Question

【題目】已知圖1、圖2中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點，且限制酶的切點是唯一的，外源DNA插入會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活。請回答有關(guān)基因工程操作的問題：

(1)圖1表示的是一個經(jīng)過____的作為載體的質(zhì)粒。作為基因表達載體除圖1所示結(jié)構(gòu)外，還需具有____。

(2)根據(jù)圖中所給信息，構(gòu)建基因表達載體時，應(yīng)選用的限制酶是____。若將基因表達載體導(dǎo)人大腸桿菌，一般先用鈣離子處理，使其成為感受態(tài)細胞，以利于____，然后調(diào)控溫度完成轉(zhuǎn)化過程。

(3)為了篩選出含目的基因的大腸桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中添加____；培養(yǎng)一段時間后，平板上長出菌落。用PCR技術(shù)鑒定時，所用的引物是圖2中____。PCR技術(shù)擴增目的基因，每一循環(huán)包括變性、____、____三步。

Answer 1

【答案】 人工改造 目的基因和終止子 BclI和HindⅢ 吸收周圍環(huán)境中的DNA分子 四環(huán)素 引物甲和引物丙 復(fù)性（退火） 延伸

【解析】試題分析：基因工程技術(shù)的基本步驟：目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）圖1表示的是一個經(jīng)過人工改造的作為載體的質(zhì)粒；基因表達載體的組成包括啟動子、終止子、目的基因和標記基因等。

（2）選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識別位點，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動子丟失，因此只能選BclI和HindⅢ兩種限制酶切割。將目的基因?qū)�入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法，即用Ca2+處理，使其處于感受態(tài)，以利于吸收周圍環(huán)境中的DNA分子；然后讓基因表達載體在緩沖液中與該細胞混合，調(diào)控溫度完成轉(zhuǎn)化過程。

（3）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，根據(jù)質(zhì)粒上的抗性基因，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素。PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈，故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙。PCR技術(shù)擴增目的基因，每一循環(huán)包括變性、復(fù)性（退火）、延伸三步。