Question

【題目】研究人員從血管內(nèi)皮瘤中發(fā)現(xiàn)了一種新的血管增生抑制劑一內(nèi)皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是獲得重組內(nèi)皮抑素的方法，請分析回答下列問題：

（1）從肝細胞中分離總RNA，經(jīng)____________獲得cDNA，之后經(jīng)過____________擴增內(nèi)皮抑素基因。

（2）擴增的目的基因與pUC18質(zhì)粒（如下圖所示）都用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，然后用DNA連接酶進行連接，構建重組質(zhì)粒。雙酶切避免了目的基因與載體____________連接，還減少了____________的連接（答不全不給分），提高了重組質(zhì)粒的比例。

（3）大腸桿菌pUC18質(zhì)粒的lacZ基因中如果沒有插入外源基因，lacZ基因便可表達出β-半乳糖苷酶，當培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時，X-gal便會被β-半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落。反之，則形成白色菌落。

選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外，還應加入______物質(zhì)。成功導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成_________顏色的菌落，原因是__________________。之所以選擇大腸桿菌作為基因工程的受體菌，其突出的優(yōu)點是：________________________。（至少答出兩點）

（4）從選擇培養(yǎng)基中挑取所需的單個菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得粗提表達產(chǎn)物。將等量毛細血管內(nèi)皮細胞接種于細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)。將等量____________的粗提表達產(chǎn)物加進培養(yǎng)孔中，72h后在顯微鏡下觀察細胞存活情況并________________________，實驗結果如下表所示。

粗提表達產(chǎn)物濃度（μg/mL）	0	2	4	6	8	10
活的內(nèi)皮細胞數(shù)目（×lO2）	12	6	2	1	0.5	0.5

實驗結果說明________________________________________________。

Answer 1

【答案】 反轉錄（或逆轉錄） PCR DNA連接 目的基因與目的基因、載體與載體 IPTG、X—gal、氨芐青霉素 白 重組質(zhì)粒的lacZ基因中插入了目的基因，使lacZ基因不能表達出β-半乳糖苷酶 單細胞，繁殖快，代謝旺盛，遺傳物質(zhì)相對較少 不同濃度 活的內(nèi)皮細胞數(shù)目 重組內(nèi)皮抑素（或粗提表達產(chǎn)物）能夠抑制毛細血管內(nèi)皮細胞增殖

【解析】試題分析：此題考查了基因工程技術，目的基因的獲得方法有三種：從基因文庫中獲取、PCR技術擴增、人工合成法。分析可知：基因表達載體中的LacZ基因會被外源基因插入滅活。

（1）從肝細胞中分離出相應的RNA，經(jīng)反轉錄（或逆轉錄）獲得內(nèi)皮抑素基因，再利用PCR技術進行體外擴增，以獲得更多的目的基因。

（2）雙酶切后，目的基因兩端的黏性末端不同，被切開的運載體兩端的黏性末端也不同，這樣可以避免目的基因與載體反向連接，還能減少目的基因與目的基因、載體與載體的連接，還減少了目的基因和質(zhì)粒的自身連接，提高了重組質(zhì)粒的比例。

（3）大腸桿菌pUC18質(zhì)粒的LacZ基因中如果沒有插入外源基因，LacZ基因便可表達出β半乳糖苷酶，當培養(yǎng)基中含有IPTG和Xgal時，Xgal便會被β半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落，反之，則形成白色菌落。選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外，還應加入的物質(zhì)有IPTG、X-gal和氨芐青霉素。因為重組質(zhì)粒的LacZ基因中插入了目的基因，使LacZ基因不能表達出β-半乳糖苷酶，所以成功導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成白色菌落。基因工程中選擇大腸桿菌作為受體細胞的原因是大腸桿菌是單細胞生物，繁殖速度快，遺傳物質(zhì)相對較少。

（4）由表中數(shù)據(jù)可知，粗提表達產(chǎn)物濃度越高，活的內(nèi)皮細胞數(shù)目越少，說明重組內(nèi)皮抑素（或粗提表達產(chǎn)物）能夠抑制毛細血管內(nèi)皮細胞的增殖。