Question

【題目】為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656個(gè)堿基對(duì)），利用基因工程大量制備琢α-淀粉酶，實(shí)驗(yàn)流程見下圖。請(qǐng)回答下列問題：

(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增α-淀粉酶基因前，需先合成兩條引物，并獲得細(xì)菌的_______________________。

(2)為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的____________________端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的_________________________。

(3)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中________的設(shè)定與引物有關(guān)，________的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。（填序號(hào)）

①加熱至90～95℃(變性)

②冷卻至55～60℃(復(fù)性)

③加熱至70～75℃(延伸)

④90～95℃維持時(shí)間

⑤55～60℃維持時(shí)間

⑥70～75℃維持時(shí)間

(4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α-淀粉酶的mRNA的部分堿基序列：

圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含________個(gè)密碼子，如虛線框后的序列未知，預(yù)測(cè)虛線框后的第一個(gè)密碼子最多有________種。

(5)獲得工程菌表達(dá)的α-淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測(cè)定酶活性，結(jié)果如下：

緩沖液	50 mmol/LNa2HPO4-KH2PO4				50 mmol/LGly-NaOH				50 mmol/LTris-HCl
pH	6.0	6.5	7.0	7.5	7.5	8.0	8.5	9.0		9.0	9.5	10.0	10.5
酶相對(duì)活性%	25.4	40.2	49.8	63.2	70.1	99.5	95.5	85.3		68.1	63.7	41.5	20.8

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為___________________________

Answer 1

【答案】基因組DNA 5’ 使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連 ② ⑥ 7 16 pH為8.0，緩沖液為50 mmol/LGly-NaOH

【解析】

PCR的原理是DNA雙鏈的復(fù)制，原料是四種游離的脫氧核苷酸，需要2種引物，需要耐高溫的DNA聚合酶。PCR包括：高溫變性；降溫復(fù)性；延伸子鏈。

（1）由題干信息可知，海洋生物含有α-淀粉酶基因，因此要首先獲得細(xì)菌的基因組DNA，從中提取并擴(kuò)增目的基因。

（2）引物可以引導(dǎo)子鏈的延伸，脫氧核苷酸是與引物的3’端相連的，故要在引物的5’端假說限制酶切點(diǎn)。常在2條引物上加入不同的限制酶切點(diǎn)，目的是使DNA片段能定向插入基因表達(dá)載體，防止自身相連。

（3）PCR擴(kuò)增時(shí)，②退火的溫度與引物長(zhǎng)短和堿基種類有關(guān)。⑥70～75℃維持時(shí)間即延伸時(shí)間長(zhǎng)短與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。

（4）圖中含有7個(gè)密碼子：AUG、CCA、UCA、ACA、AAU、ACU、AAG。虛線框后密碼子的第一位堿基是G，第二位有4種可能性，第三位有4種可能性，故密碼子種類是4×4=16種。

（5）由圖表可知，pH為8.0，緩沖液為50 mmol/LGly-NaOH中酶活性最高，為99.5。