Question

【題目】稻瘟病是水稻最重要的病害之一，為達到防治目的，科研人員通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出了抗稻瘟病水稻品種�；卮鹣铝袉栴}：

（1）通過 RT-PCR 技術(shù)以抗稻瘟病基因的 RNA 為模板擴增出 cDNA。在 PCR 過程中，兩個引物是_____酶的結(jié)合位點；用 cDNA 單鏈與該抗性水稻植株的單鏈 DNA 進行分子雜交，可能出現(xiàn)游離的單鏈區(qū)，其原因是_____。

（2）利用 RT-PCR 技術(shù)擴增基因時，設(shè)計兩種引物的堿基序列的主要依據(jù)是_____，為了便于擴增后的X 基因與質(zhì)粒連接，常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制酶酶切位點，主要目的是_____。

（3）基因工程中，將重組質(zhì)粒導入植物細胞采用最多的方法是_____，導入動物受精卵采用的方法是_____。

（4）若要檢測抗稻瘟病基因是否翻譯出相應(yīng)蛋白質(zhì)，可采用的分子水平的檢測方法是_____。

Answer 1

【答案】熱穩(wěn)定DNA聚合 DNA分子含有內(nèi)含子非編碼區(qū)等序列，mRNA分子中沒有相應(yīng)互補的堿基序列 X基因兩端的部分脫氧核苷酸序列 使X基因能定向插入表達載體，減少自連 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射法 抗原-抗體雜交

【解析】

1、有關(guān)PCR技術(shù)的相關(guān)知識：

（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

（2）原理：DNA復制。

（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。

（4）過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物結(jié)合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。

2、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）在PCR過程中，兩個引物是熱穩(wěn)定DNA聚合酶的結(jié)合位點；用cDNA單鏈與該抗性水稻植株的單鏈DNA進行分子雜交，由于DNA分子含有內(nèi)含子、非編碼區(qū)等序列，mRNA分子中沒有相應(yīng)互補的堿基序列，因此逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA中缺少該序列，所以出現(xiàn)游離的單鏈區(qū)。

（2）用PCR技術(shù)擴增X基因時，設(shè)計兩種引物的堿基序列的主要依據(jù)是X基因兩端的部分脫氧核苷酸序列，為了便于擴增后的X基因與質(zhì)粒連接，常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制酶酶切位點，主要目的是使X基因能定向插入表達載體，減少酶切產(chǎn)物自身環(huán)化。

（3）將目的基因?qū)�入植物細胞采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，農(nóng)桿菌能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，將質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞。將目的基因?qū)�入動物細胞常用顯微注射法，這也是將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法�?/span>

（4）若要檢測抗稻瘟病基因是否翻譯出相應(yīng)蛋白質(zhì)，分子水平上可采用抗原-抗體雜交法進行檢測。