Question

【題目】雞干抗素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動物領(lǐng)域的抗病毒治療�？蒲腥藛T將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細(xì)胞的流程，①-④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題：

(1)步驟①中，利用PCR技術(shù)擴增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是_____________�？蒲腥藛T還在兩種引物的一端分別加上了______________和_____________序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。

(2)步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中末標(biāo)注出的必需元件還有_______________________，步驟③中需先用__________________處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。

(3)步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA，再通過PCR擴增制備探針，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是_________________________。

(4)用煙草花葉病毒對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草和普通煙草進(jìn)行接種實驗，接種后第19天對照組植株進(jìn)入病情指數(shù)(植物受病毒侵染的嚴(yán)重程度)為100的平臺期，而轉(zhuǎn)基因植株在第______天才進(jìn)入平臺期，但此時的病情指數(shù)為79，說明轉(zhuǎn)基因煙草植株對病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，可能的原因有_______________________________。

Answer 1

【答案】雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 復(fù)制原點 Ca2+ 雞干擾素基因未能導(dǎo)人煙草愈傷組織細(xì)胞(或?qū)�入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄) 22 實驗得到的干擾素表達(dá)量較低,未能很好啟動機體產(chǎn)生抗性;(或:病毒接種量過大,相對來說干擾素誘導(dǎo)調(diào)控作用滯后;或:植物體內(nèi)缺乏干擾素受體,導(dǎo)致外源基因表達(dá)的干擾素誘導(dǎo)或調(diào)控作用減弱)

【解析】

基因工程的工具：限制酶、DNA連接酶、運載體。

基因工程的操作步驟：目的基因的獲�。粯�(gòu)建基因表達(dá)載體（基因工程的核心步驟）；把目的基因?qū)�入受體細(xì)胞（顯微注射法、鈣離子處理法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）；目的基因的檢測和鑒定（分子水平、個體水平）。

①獲取目的基因、②構(gòu)建基因表達(dá)載體、③把目的基因?qū)�入農(nóng)桿菌細(xì)胞、④目的基因的篩選和鑒定。

（1）進(jìn)行PCR時，需要根據(jù)已知目的基因即雞干擾素基因兩端的一段序列合成引物，為了便于后續(xù)的限制酶的剪切和DNA連接酶的連接，應(yīng)該在兩種引物的一端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列，即GAATTC和GGATCC。

（2）②構(gòu)建基因表達(dá)載體應(yīng)該含有目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因和圖中未標(biāo)出的復(fù)制原點。③把目的基因?qū)�入農(nóng)桿菌細(xì)胞，因為農(nóng)桿菌是微生物，需要經(jīng)過鈣離子處理，使其處于感受態(tài)。

（3）若在愈傷組織細(xì)胞中通過DNA分子雜交法未檢測出干擾素基因，可能是雞干擾素基因未成功導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞中。

（4）由圖可知，普通煙草在接種后第19天對照組植株進(jìn)入病情指數(shù)(植物受病毒侵染的嚴(yán)重程度)為100的平臺期，而轉(zhuǎn)基因植株在第22天才進(jìn)入平臺期，但此時的病情指數(shù)為79，可能是因為實驗得到的干擾素表達(dá)量較低，未能很好的啟動機體產(chǎn)生抗性，使得抗性比較低。