Question

下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圈l、圈2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)．請回答下列問題：

（1）一個如圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有

 

個游離的磷酸基團(tuán)．
（2）若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越

 

．
（3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SrnaⅠ切割，原因是

 

．
（4）與只使用EcoR I相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止

 

．
（5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入

 

酶．
（6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了

 

．
（7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在

 

的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達(dá)的初步檢測．

Answer 1

考點(diǎn)：基因工程的原理及技術(shù)

專題：

分析：第一步：目的基因的獲取
（1）目的基因是指：編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因．
（2）原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成．人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法．
（3）PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
①原理：DNA雙鏈復(fù)制
②過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成．
第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建
（1）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用．
（2）組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因
①啟動子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)．
②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端．
③標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來．常用的標(biāo)記基因是抗生素基因．
第三步：將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞
（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程．
（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：
將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等．
將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)．此方法的受體細(xì)胞多是受精卵．
將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞：
（3）重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)．
第四步：目的基因的檢測和表達(dá)
（1）首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)．
（2）其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交．
（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原--抗體雜交． （4）有時還需進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定．如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀．
（5）基因文庫：是將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中通過克隆而儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，叫做基因文庫．建立基因文庫的目的就是為獲得大量的目的基因作準(zhǔn)備．如果基因文庫中含有一種生物的所有基因，這個基因文庫就叫基因組文庫．

解答： 解：
（1）由于質(zhì)粒在切割前是一個環(huán)狀DNA分子，因此上面沒有游離的磷酸基團(tuán)；當(dāng)質(zhì)粒被切割后形成了兩個末端各有1個游離的磷酸基團(tuán)，故共有2個游離的磷酸基團(tuán)．
（2）SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，表示G和C這一對堿基對所占的比例就超高，而G和C之間含有三個氫鍵，故其熱穩(wěn)定性超高．
（3）質(zhì)粒抗生素抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，由圖可知，標(biāo)記基因和外源DNA目的基因中 均含有SmaI酶切位點(diǎn)，都可以被SmaI酶破環(huán)，故不能使用該酶剪切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA．
（4）構(gòu)建含目的基因的重組質(zhì)粒A時，選用 BamhHI 和HindⅢ酶對外源DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割，這樣使目的基因兩端的黏性末端不同，可以防止含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，同理，也可以防止質(zhì)粒自身環(huán)化．
（5）為了使目的基因和質(zhì)粒之間的磷酸二脂鍵相連，需要用DNA連接酶相連接．
（6）抗生素抗性基因是一種抗性基因，抗性基因是為了鑒別和篩選目的基因是否導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)．
（7）由于分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)，然后所給的培養(yǎng)基應(yīng)為蔗糖為唯一含碳源的培養(yǎng)基．
故答案為：
（1）0、2
（2）高
（3）SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因
（4）質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化
（5）DNA連接
（6）鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞
（7）蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì)

點(diǎn)評：本題以抗病香蕉味素材，考查基因工程和植物組織培養(yǎng)的相關(guān)知識，意在考查考生的理解能力、識記能力和應(yīng)用能力．