Question

【題目】CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由Cas9蛋白（一種核酸酶）和sgRNA（向?qū)?/span>RNA）構(gòu)成的RNA-蛋白復(fù)合體，可利用sgRNA識(shí)別并結(jié)合特定DNA序列，引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)目的基因進(jìn)行編輯（如圖所示）。RuBisCo是參與光合作用的關(guān)鍵酶，研究人員擬利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)大豆細(xì)胞RuBisCo基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，以達(dá)到提高CO2利用率的目的，回答下列問(wèn)題：

（1）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)，Cas9蛋白可催化_______________（化學(xué)鍵名稱）水解，剪切特定DNA片段，因此Cas9蛋白的這一功能與_______________酶相似。

（2）用于編輯不同基因的CRISPR/Cas9復(fù)合物中sgRNA堿基序列不同，因此首先要確定RuBisCo基因中的待編輯序列，根據(jù)_______________原則設(shè)計(jì)引物，通過(guò)_______________技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的基因序列，作為編碼特定sgRNA的模板。該技術(shù)所需的Taq酶特點(diǎn)是_______________，能使整個(gè)反應(yīng)體系中DNA解鏈、退火、鏈的延伸都能快速進(jìn)行。

（3）將擴(kuò)增獲得的DNA片段與_______________基因共同導(dǎo)入到質(zhì)粒載體，構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體，將構(gòu)建成功的表達(dá)載體通過(guò)_______________方法，導(dǎo)入大豆細(xì)胞。若檢測(cè)到受體細(xì)胞中組成RuBisCo酶的氨基酸_______________發(fā)生了符合預(yù)期的改變，則表明基因編輯成功。

（4）CRISPR/Cas9系統(tǒng)在定點(diǎn)編輯基因時(shí)仍存在一個(gè)最大的弊端，就是有很大概率會(huì)造成其他一些非目的基因序列的錯(cuò)誤剪接和編輯，請(qǐng)嘗試分析其原因_______________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯鍵 限制/限制性核酸內(nèi)切 堿基互補(bǔ)配對(duì) PCR 耐高溫 Cas9（蛋白） 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化/農(nóng)桿菌 種類、數(shù)目、排列順序 其他基因序列也可能含有能與SgRNA互補(bǔ)配對(duì)的序列，造成SgRNA和Cas9的錯(cuò)誤結(jié)合并且剪切

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：

分子水平上的檢測(cè)：

①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；

②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；

③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。

個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）Cas9蛋白能剪切特定DNA片段，這與限制酶的功能相似，可催化DNA中磷酸二酯鍵水解。

（2）要確定RuBisCo基因中的待編輯序列，可根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增相應(yīng)的基因序列，作為編碼特定sgRNA的模板。該技術(shù)所需的Taq酶能耐高溫，使整個(gè)反應(yīng)體系中DNA解鏈、退火、鏈的延伸都能快速進(jìn)行。

（3）要構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體，需要將擴(kuò)增獲得的DNA片段與Cas9蛋白基因共同導(dǎo)入到質(zhì)粒載體，將表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞通常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。若檢測(cè)到受體細(xì)胞中組成RuBisCo酶的氨基酸種類、數(shù)目、排列順序發(fā)生了符合預(yù)期的改變，則表明基因編輯成功。

（4）因其他基因序列也可能含有能與SgRNA互補(bǔ)配對(duì)的序列，造成SgRNA和Cas9的錯(cuò)誤結(jié)合并且剪切，這會(huì)導(dǎo)致CRISPR/Cas9系統(tǒng)在定點(diǎn)編輯基因時(shí)有很大概率會(huì)造成其他一些非目的基因序列的錯(cuò)誤剪接和編輯。