Question

【題目】許多大腸桿菌的質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ′基因（內(nèi)含EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)），其編碼的產(chǎn)物β—半乳糖苷酶在X—gal和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色�；�因工程中常利用該原理從導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞中篩選出真正導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞，過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)據(jù)圖回答：

（1）獲取目的基因時(shí)，可以從____________中直接提取。

（2）限制酶EcoRⅠ的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是-G↓AATTC-，SmaⅠ的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是-CCC↓GGG-。圖中目的基因被切割下來(lái)和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接相成的末端，連接的末端序列是______。

（3）在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程中，除了目的基因外，還必須有_________和_________、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因等。

（4）轉(zhuǎn)化過(guò)程中，大腸桿菌應(yīng)先用____________處理，使其成為____________細(xì)胞。

（5）菌落①②③中顏色為白色的是____________（填序號(hào)），原因是_______________。

（6）菌落③中的目的基因是否表達(dá)，可采用的分子檢測(cè)辦法是____________。

Answer 1

【答案】基因文庫(kù)-TTAA啟動(dòng)子終止子Ca2+感受態(tài)③lacZ′標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因后被破壞，不能表達(dá)出β-半乳糖苷酶，故菌落為白色抗原-抗體雜交

【解析】

分析題圖，目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，右側(cè)是限制酶SmaI的識(shí)別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，則需要用限制酶EcoRI來(lái)切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和SmaI來(lái)切割含有目的基因的外源DNA分子，而這樣會(huì)使目的基因右側(cè)無(wú)法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來(lái)和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA；用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時(shí)，會(huì)破壞質(zhì)粒上的lacZ'基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，菌落顏色為白色。

（1）基因工程中，目的基因可以從基因文庫(kù)中直接獲取。

（2）根據(jù)以上分析可知，圖中目的基因被切割下來(lái)和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA。

（3）基因表達(dá)載體的組成成分包括目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等。

（4）將目的基因?qū)�入大腸桿菌細(xì)胞之前，應(yīng)先用Ca2+處理大腸桿菌，使其處于能吸收周?chē)鶧NA的感受態(tài)。

（5）根據(jù)以上分析已知，用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時(shí)，會(huì)破壞質(zhì)粒上的lacZ‘基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG存在下，菌落顏色為白色。

（6）檢測(cè)目的基因是否表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可采用抗原——抗體雜交法。