Question

【題目】近年來(lái)，在處理富營(yíng)養(yǎng)化水體的污水過(guò)程中，與化學(xué)、物理除氮方法比較，目前認(rèn)為微生物反硝化去除氮素污染更為經(jīng)濟(jì)有效�？蒲泄ぷ髡卟捎没�因工程技術(shù)構(gòu)建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，進(jìn)行了相關(guān)研究。請(qǐng)回答問(wèn)題。

（1）微生物的反硝化作用，是氮循環(huán)中一個(gè)重要的生物過(guò)程。亞硝酸鹽還原酶（Nir）是該過(guò)程的關(guān)鍵酶，是由野生菌株YP4的反硝化基因（nirS）轉(zhuǎn)錄后，再翻譯出具有___________作用的蛋白質(zhì)。

（2）工程菌的構(gòu)建

①研究者利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查到nirS基因的堿基序列，設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增nirS基因。PCR技術(shù)利用了___________的原理，使用耐高溫Taq酶而未使用普通DNA聚合酶的主要原因是______________________。

②研究者用HindⅢ和BamHI兩種限制酶處理nirS基因與p質(zhì)粒，在_______________酶的作用下進(jìn)行體外連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，在含慶大霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，如果用HindⅢ和BamHI雙酶切，得到兩個(gè)片斷電泳結(jié)果分別與_______________電泳結(jié)果基本一致，說(shuō)明獲得重組質(zhì)粒pYP4S。

③將pYP4S轉(zhuǎn)化到野生菌株YP4中形成工程菌YP4S，培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定。為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖1所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的最佳一對(duì)引物組合是_________。某學(xué)生錯(cuò)選了圖中的另外一對(duì)引物組合，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為2．1kb的片段，原因是_______________。

（3）檢測(cè)工程菌YP4S除氮的效能

①工程菌株YP4S在已滅菌的模擬污水中培養(yǎng)36h后，檢測(cè)結(jié)果如圖2。結(jié)果表明___________________。

②要進(jìn)一步證明工程菌對(duì)含氮污水治理更有效，應(yīng)___________________________。

Answer 1

【答案】催化 DNA復(fù)制 PCR過(guò)程中DNA在高溫下解鏈，這樣的高溫下，普通的DNA聚合酶的生物活性喪失 DNA連接 p質(zhì)粒和插入片段（目的基因） 乙和丙 目的基因反向連接 工程菌株除氮效果優(yōu)于野生菌 Ⅰ．工程菌YP4S與野生菌分別處理實(shí)際污水36hⅡ．檢測(cè)除氮率

【解析】

分析題干可知：目前認(rèn)為微生物反硝化去除氮素污染更為經(jīng)濟(jì)有效，科研工作者采用基因工程技術(shù)構(gòu)建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，故需依據(jù)基因工程的相關(guān)原理進(jìn)行分析作答。

（1）亞硝酸鹽還原酶（Nir）是該過(guò)程的關(guān)鍵酶，酶是經(jīng)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程形成的有催化作用的蛋白質(zhì)。

（2）①PCR技術(shù)依據(jù)的原理是DNA分子的復(fù)制；因PCR過(guò)程中DNA解旋是在在高溫下進(jìn)行的（90-95℃），這樣的高溫下，普通的DNA聚合酶的生物活性喪失，故在PCR技術(shù)中應(yīng)采用使用耐高溫的Taq酶。

②連接兩個(gè)DNA片段所用的酶是DNA連接酶；因?qū)嶒?yàn)中nirS基因與p質(zhì)粒是分別用HindⅢ和BamHI兩種限制酶處理的，故若再用HindⅢ和BamHI雙酶切之后，得到兩個(gè)片斷電泳結(jié)果分別與p質(zhì)粒和插入片段（nirS基因）電泳結(jié)果基本一致，可說(shuō)明獲得重組質(zhì)粒pYP4S。

③PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反方向合成子鏈，結(jié)合目的基因的插入位置可知，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的最佳一對(duì)引物組合是乙和丙；若某學(xué)生錯(cuò)選了圖中的另外一對(duì)引物組合（甲和乙），只有反向連接后才能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為2．1kb的片段 （2＋0.1kb）。

（3）①圖2結(jié)果表明，無(wú)論是總氮還是NH4＋、NO3—的去除率，工程菌株除氮效果優(yōu)于野生菌。

②因圖2是工程菌株YP4S在已滅菌的模擬污水中的處理結(jié)果，故要進(jìn)一步證明工程菌對(duì)含氮污水治理更有效，應(yīng)用工程菌YP4S與野生菌分別處理實(shí)際污水36h，檢測(cè)除氮率。