Question

【題目】人體內(nèi)的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和腦血栓的急救藥。然而，為心�；颊咦⑸浯髣┝康�t-PA會誘發(fā)顱內(nèi)出血，其原因在丁t-PA作用的特異性不高。研究證實(shí)，將t-PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低出血副作用。

(1)依據(jù)所需t-PA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，對天然的t-PA基因進(jìn)行序列改造，可制造出性能優(yōu)異的t-PA突變蛋白，該技術(shù)稱為_______________。

(2)已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板鏈序列為ACA，而絲氨酸的密碼子為UCU，因此突變基因編碼該氨基酸的模板鏈序列應(yīng)設(shè)計(jì)為______________。

(3)若獲得的t-PA突變基因如下圖所示，那么質(zhì)粒pCLY11需用_______________兩種限制酶切開，才能與t-PA突變基因高效連接。

(4)將連接成功的基因表達(dá)載休導(dǎo)入大腸桿菌中，在含有___________的培養(yǎng)基上挑選顏色呈____________的菌落，初步篩選導(dǎo)入成功的細(xì)胞。

(5)檢測t-PA突變基因是否導(dǎo)入大腸桿菌，可利用t-PA突變基因制備探針，進(jìn)行_______________，檢測是否有雜交鏈；也可依據(jù)t-PA突變基因兩端的序列設(shè)計(jì)引物對大腸桿菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若出現(xiàn)了_______________說明t-PA突變基因已經(jīng)導(dǎo)入了受體細(xì)胞。

(6)在上述步驟成功的基礎(chǔ)上，若沒有能從大腸桿菌中提取到相應(yīng)的t-PA突變蛋白，其可能的原因是________________。

Answer 1

【答案】蛋白質(zhì)工程 AGA XmaⅠ和BglⅡ 新霉素 白色 DNA分子雜交 擴(kuò)增產(chǎn)物（子代DNA） 目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常

【解析】

1、蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)）

2、蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推測應(yīng)有的氨基酸序列，找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白質(zhì)工程特有的途徑；以下按照基因工程的一般步驟進(jìn)行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）

（1）通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求，該技術(shù)成為蛋白質(zhì)工程。

（2）因?yàn)橹圃煨阅軆?yōu)異的t-PA突變蛋白，是將t-PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的編碼序列（即模板鏈的互補(bǔ)鏈序列）為ACA，而絲氨酸的密碼子為UCU，因此突變基因編碼該氨基酸的編碼序列應(yīng)設(shè)計(jì)為AGA。

（3）由于目的基因的兩端的堿基序列分別是CCGG、CTAG，所以應(yīng)用XmaI和BglII兩種限制酶切割，以便于把目的基因連接到質(zhì)粒pCLY11上。

（4）由圖1可知，將連接好的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌中，由于限制酶切割質(zhì)粒破壞了mlacZ基因，所以含t-PA突變基因重組DNA分子的細(xì)胞應(yīng)具有的表型是新霉素抗性且呈白色，所以可以在含新霉素的培養(yǎng)基上挑選白色的菌落。

（5）檢測目的基因是否倒入受體細(xì)胞可以用t-PA突變基因制備探針，進(jìn)行DNA分子雜交；也可以依據(jù)t-PA突變基因兩端的序列設(shè)計(jì)引物對大腸桿菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果出現(xiàn)子代DNA分子，說明已經(jīng)倒入受體細(xì)胞。

（6）如果已經(jīng)檢測到基因，但沒有相關(guān)的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的合成需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，所以可能原因是目的基因沒有轉(zhuǎn)錄和翻譯。