Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動(dòng)物領(lǐng)域的抗病毒治療。科研人員將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細(xì)胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如表所示。請(qǐng)回答下列問題：

（1）表格中的限制酶EcoRⅠ切割DNA分子后形成的黏性末端是_________________。

（2）步驟①是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增雞干擾素基因，進(jìn)行PCR的前提是___________。

（3）圖中選用兩種限制酶分別處理雞干擾素基因和農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒，這樣做的優(yōu)點(diǎn)有_________。

（4）步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子的作用是 ____________。

（5）步驟③中需先用____________處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。

（6）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA，再通過PCR擴(kuò)增制備探針，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是__________________。

Answer 1

【答案】和 有一段已知目的基因的核苷酸序列 避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化、避免目的基因與質(zhì)粒反向連接 RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 Ca2+ 干擾素基因未導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞（或干擾素基因在煙草愈傷組織細(xì)胞中未轉(zhuǎn)錄）

【解析】

分析圖解，圖中過程①表示獲取目的基因，過程②表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建，過程③表示將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，過程④表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）表格中的限制酶EcoRⅠ識(shí)別的序列是，并在G和A之間切開，故切割DNA分子后形成的黏性末端是和。

（2）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是有一段已知干擾素基因兩端的部分核苷酸序列。

（3）圖中選用兩種限制酶分別處理雞干擾素基因和農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒，這樣做的優(yōu)點(diǎn)有避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化、避免目的基因與質(zhì)粒反向連接。

（4）步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子的作用是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合位點(diǎn)，可以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

（5）步驟③中，微生物細(xì)胞作為受體細(xì)胞時(shí)，需要鈣離子處理使其變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞，因此過程③中需先用Ca2+（或CaCl2）處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。。

（6）提取的愈傷組織細(xì)胞的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄過程得到DNA；最終未能檢測出干擾素基因，可能是因?yàn)殡u干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞（或干擾素基因在煙草愈傷組織細(xì)胞中未轉(zhuǎn)錄）。