Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動(dòng)物領(lǐng)域的抗病毒治療�？蒲腥藛T將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草�；卮饐�(wèn)題：

(1)目的基因合成后可在Taq酶的作用下通過(guò)PCR技術(shù)大量擴(kuò)增，該技術(shù)的原理是________________________。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，需要加入兩種引物，原因是_____________________________________。

(2)基因表達(dá)載體中應(yīng)有RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，該部位稱為_________________。將基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌常用的方法是___________________________________。

(3)該實(shí)驗(yàn)中，將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁。請(qǐng)從理論角度提出實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)原生質(zhì)體是否再生出細(xì)胞壁的一種方法：________________________。

(4)科研人員提取煙草愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過(guò)__________獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若最終未能檢測(cè)出干擾素基因，可能原因是____________________；若轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，可能原因是__________________。

Answer 1

【答案】DNA的熱變性（或DNA雙鏈復(fù)制） DNA兩條鏈反向平行，DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)擴(kuò)增 啟動(dòng)子 感受態(tài)細(xì)胞法（或Ca2+轉(zhuǎn)化法） 將細(xì)胞置于高滲溶液中，用顯微鏡觀察細(xì)胞是否發(fā)生質(zhì)壁分離（或?qū)⒓?xì)胞置于清水中，用顯微鏡觀察細(xì)胞是否脹破） 逆轉(zhuǎn)錄 雞干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞（或?qū)�入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄） 轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)干擾素的合成量較低（或合成的干擾素生物活性低）

【解析】

1、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

2、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：①原理：DNA雙鏈復(fù)制；②過(guò)程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。

（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，依據(jù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制的原理，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩條鏈兩端的部分核苷酸序列，由于DNA兩條鏈反向平行，而DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA子鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)擴(kuò)增。

（2）基因表達(dá)載體必需具備的成分有目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子和復(fù)制原點(diǎn)，其中啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，將基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌（微生物）時(shí)，常用Ca2+處理，使其處于感受態(tài)，因此將基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌的方法是Ca2+轉(zhuǎn)化法。

（3）根據(jù)題意，該實(shí)驗(yàn)中將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞的原生質(zhì)體后，需再生細(xì)胞壁，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)原生質(zhì)體是否再生出細(xì)胞壁，可以將細(xì)胞置于高滲溶液中，觀察是否發(fā)生質(zhì)壁分離，如果發(fā)生質(zhì)壁分離說(shuō)明新的細(xì)胞壁已經(jīng)形成。

（4）提取的愈傷組織細(xì)胞的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程得到DNA；最終未能檢測(cè)出干擾素基因，可能是因?yàn)殡u干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞或?qū)�入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄。若轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)干擾素的合成量較低或者合成的干擾素生物活性低。