Question

【題目】I.泡菜發(fā)酵過程中會產生亞硝酸鹽。請回答：

（1）泡菜制作過程中所利用的微生物主要是_____，其代謝類型為_____該微生物與酵母菌在細胞結構方面最主要的區(qū)別為_____。

（2）實驗中利用比色法測定泡菜液中亞硝酸鹽含量，其中的顯色原理是：在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生_______反應后，與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結合形成_____色染料。

（3）泡菜發(fā)酵初期，亞硝酸鹽含量快速升高的原因是__________。有人認為，發(fā)酵后期亞硝酸鹽含量降低的原因可能是“泡菜發(fā)酵的主要菌種能夠降解亞硝酸鹽”。請設計一個實驗驗證該觀點（寫出實驗思路即可）。____________________。

Ⅱ.海洋石油污染日益引起關注，利用工程菌進行降解具有巨大的應用潛力。P450是石油降解的關鍵酶，用Sall和Nde I聯合酶切獲得的P450基因，與質粒pCom8重組后，導入大腸桿菌獲得工程菌。

（注：黑色素合成基因表達能使白色菌落變成黑色，箭頭位置表示限制酶切割位占）

請回答：

（1）構建重組質粒時，應選用限制酶________切割pCom8，原因是________。

（2）由于重組質粒導入受體細胞的成功率很低，所以需要經過________才能獲得工程菌。操作的大致思路是：將待檢菌液接種到含有________的固體培養(yǎng)基上，選擇顏色為________的菌落擴大培養(yǎng)，即可獲得所需的工程菌

（3）從工程菌中提取重組質粒，若用Nde I y Sall聯合酶切，是否能得到P450基因？________（填“是”或“否”），理由是________________。

Answer 1

【答案】乳酸菌 異養(yǎng)厭氧型 沒有核膜包被的細胞核 重氮化 玫瑰紅 微生物大量繁殖，代謝產生的亞硝酸鹽增加 取泡菜發(fā)酵的主要菌種，在含亞硝酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一段時間后檢測培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的含量。若下降，則證明該觀點正確 XhoI和NdeI 用這兩種酶切割pCom8質粒后，產生的末端能與P450基因的粘性末端互補 篩選 慶大霉素 白色 否 當P450基因與被限制酶XhoI和NdeI切割的pCom8質粒重組后，不存在能被限制酶SalI識別的序列

【解析】

I泡菜制作的過程運用了傳統(tǒng)的發(fā)酵技術，泡菜制作所使用的微生物是乳酸菌，乳酸菌的代謝類型是異養(yǎng)厭氧型，在無氧條件下乳酸菌能夠大量繁殖，并把糖轉化為乳酸，膳食中的亞硝酸鹽在特定的條件下會轉變?yōu)橹掳┪铮�在泡菜腌制過程中，由于壇內環(huán)境中硝酸還原菌的繁殖，促進硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，但隨腌制時間延長，乳酸菌大量繁殖，產生乳酸，抑制硝酸鹽還原菌繁殖，使亞硝酸鹽含量逐漸下降。

Ⅱ分析圖1:圖1中限制酶XhoI的切割位點位于黑色素合成基因上,該基因表達能使白色的菌落變成黑色;限制酶SspI的切割位點位于慶大霉素(一種抗生素)抗性基因上。

分析圖2:圖2表示幾種限制酶的識別序列和切割位點,其中SaI和XhoI切割后露出的黏性末端是相同的。

I (1)泡菜制作過程中所利用的微生物主要是乳酸菌，其代謝類型為異養(yǎng)厭氧型。乳酸菌是原核生物，與酵母菌在細胞結構方面最主要的區(qū)別為沒有核膜包被的細胞核。

(2)實驗中利用比色法測定泡菜液中亞硝酸鹽含量，顯色原理是在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應后，與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結合形成玫瑰紅色染料。

(3)泡菜發(fā)酵初期，亞硝酸鹽含量快速升高的原因是微生物大量繁殖，代謝產生的亞硝酸鹽增加。有人認為，發(fā)酵后期亞硝酸鹽含量降低的原因可能是“泡菜發(fā)酵的主要菌種能夠降解亞硝酸鹽”。實驗驗證該觀點的實驗思路是：取泡菜發(fā)酵的主要菌種,在含亞硝酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一段時間后檢測培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量若下降，則證明該觀點正確。

Ⅱ(1)根據題干信息“用Sall和Nde I聯合酶切獲得的P450基因”可知獲取目的基因時用的限制酶是Sall和Nde I,由于質粒中沒有限制酶Sall的切割位點,又因為乙圖顯示Sall和XhoI切割后露出的黏性末端是相同的,因此可以用Nde I、XhoI切割質粒。

(2)由于重組質粒導入受體細胞的成功率很低,所以需要經過篩選才能獲得工程菌。由于重組質粒上含有標記基因-慶大霉素(一種抗生素)抗性基因,因此培養(yǎng)基中還必須添加慶大霉素。甲圖中XhoI是黑色素合成基因,其表達能使白色的菌落變成黑色,但在構建基因表達載體時,該基因已經被限制酶切割和破壞了,因此導入重組質粒的工程菌不能合成黑色素,即應該選擇白色菌落擴大培養(yǎng)即可獲得所需的工程菌。

(3)當P450基因與被限制酶Nde I和XhoI切割的pCom8質粒重組后,不存在限制酶Sall識別的序列,因此若對重組質粒再次使用上述限制酶(Nde I、XhoI)切割,由于只有限制酶Nde I能起作用,因此不能獲得P450基因。