Question

【題目】圖1為某一質粒載體，外源DNA分子插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。圖2中的三個DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三種限制性內切酶的識別序列與切割位點。回答下列有關基因工程的問題：

(1)經Sau3A I酶切割得到的目的基因可以與上述表達載體被____酶切后的產物連接，理由是_____________。

(2)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_____。用DNA連接酶處理限制酶切產物得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。首先用含有_____培養(yǎng)基進行篩選，上述大腸桿菌細胞中，_____不能在培養(yǎng)基生存，但是含有______的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是_______________。在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有_____________的固體培養(yǎng)基。

Answer 1

【答案】BamHⅠ 兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端 T4DNA連接酶 四環(huán)素 未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌 質粒載體和插入了目的基因的重組質粒 二者均含有四環(huán)素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均生長 氨芐青霉素

【解析】

1、運載體：

（1）常用的運載體：質粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。

（2）作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點； ②要有標記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選③能在宿主細胞中穩(wěn)定存在并復制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來。

2、識圖分析可知，圖1中的質粒上Amp′表示氨芐青霉素抗性基因，Tet′表示四環(huán)素抗性基因，可以作為標記基因，限制酶EcoR I、BamH I的酶切位點位于Amp′氨芐青霉素抗性基因中。

圖2依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，分析圖可知，限制酶BamH I和Sau3A I切割后形成的黏性末端序列可以互補配對。

（1）分析圖解可知，限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切割后形成的黏性末端相同，因此經BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與表達載體被Sau3AⅠ酶切后的產物連接。

（2）DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，包括T4DNA連接酶和E.coliDNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是僅含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒。由于BamHⅠ酶會破壞青霉素抗性基因，因此含有目的基因的重組質粒的大腸桿菌不能產生抗青霉素物質，四環(huán)素抗性基因沒有破壞，能產生抗四環(huán)素的物質，因此該大腸桿菌能抗四環(huán)素素而不能抗氨芐青霉素; 僅含有環(huán)狀目的基因的沒有標記基因存在，因此既不能抗青霉素也不能抗四環(huán)素；含有質粒載體的既可以抗青霉素也可以抗四環(huán)素。所以首先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基分離微生物，其中未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌不能在培養(yǎng)基生存，但是含有質粒載體和插入了目的基因的重組質粒的細胞能夠生存下來，二者不能區(qū)分，若要區(qū)分二者，還需使用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選，其中含有質粒載體的能夠生存。