Question

【題目】金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白。某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖圖像，請回答下列問題：

（1）從高表達MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過______________獲得cDNA用于PCR擴增。

（2）設(shè)計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物（引物1和引物2），為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點。設(shè)計引物時需要避免引物之間形成______________，而造成引物自連。

（3）圖中步驟1代表____________________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。

（4）PCR擴增時，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會破______________的堿基配對。退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但______________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

（5）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，則可以采取的改進措施有______________（填序號：①升高退火溫度 ②降低退火溫度 ③重新設(shè)計引物）。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 堿基互補配對 變性 引物與模板 GC含量高 ②③

【解析】

PCR技術(shù)：
1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。
2、原理：DNA復(fù)制。
3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。
4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。
5、過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈；PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。

（1）PCR擴增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，從而用于PCR擴增。

（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點，設(shè)計的引物之間不能有堿基互補配對，否則引物自連，而不能與模板相連。
（3）圖中步驟1、2、3分別代表變性、退火、延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。
（4）退火表示引物與模板相連，若退火溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對；由于G-C之間有三個氫鍵，A-T之間有兩個氫鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高。
（5）PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，可能是退火溫度過高，導(dǎo)致引物與模板不能相連或引物間相互配對，引物自連，不能與模板相連，因此，可通過②降低退火溫度或③重新設(shè)計引物進行改進。