Question

【題目】口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種動(dòng)物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預(yù)防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白VP1�？茖W(xué)家嘗試?yán)�用轉(zhuǎn)基因番茄來(lái)生產(chǎn)口蹄疫疫苗。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。

（1）上圖是VP1基因、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，若用以構(gòu)建具有VP1基因的基因表達(dá)載體，還需要在質(zhì)粒中插入__________________。

（2）口蹄疫病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，則獲得可重組到質(zhì)粒的VP1基因必須用到____________酶。要獲得大量VP1基因，可利用__________技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。

（3）通常用BamHⅠ、HindⅢ兩種限制酶切割VP1基因和Ti質(zhì)粒的目的是____________________。要篩選出含有該目的基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，首先需要在含________________的培養(yǎng)基上進(jìn)行。

（4）VP1基因應(yīng)插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過(guò)轉(zhuǎn)化作用進(jìn)入番茄細(xì)胞并插入到______________，使VP1基因能夠穩(wěn)定存在并發(fā)揮作用。

（5）獲得表達(dá)VP1蛋白的番茄植株以后，要進(jìn)行免疫效力的測(cè)定，具體方法是將從轉(zhuǎn)基因番茄葉片中提取的VP1蛋白質(zhì)注射到一定數(shù)量的豚鼠體內(nèi)，每半個(gè)月注射一次，三次注射后檢測(cè)豚鼠血液中產(chǎn)生的___________________數(shù)量，為了使結(jié)果可信，應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照組。

Answer 1

【答案】啟動(dòng)子 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 防止VP1基因、Ti質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接 卡那霉素 染色體DNA VP1蛋白的抗體

【解析】

基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中，目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因不可缺少，其中標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，據(jù)題意可知，目的基因是VP1基因。

（1）上圖是VP1基因、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，已經(jīng)具備復(fù)制原點(diǎn)、終止子、標(biāo)記基因、目的基因等，因此還需要在質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子。

（2）口蹄疫病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，因此要獲得可重組到質(zhì)粒的VP1基因，必須先逆轉(zhuǎn)錄生成相應(yīng)的DNA，需用到逆轉(zhuǎn)錄酶。要獲得大量VP1基因，可利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。

（3）如果只用同一種限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端相同，會(huì)出現(xiàn)目的基因、運(yùn)載體自身環(huán)化，或者目的基因和運(yùn)載體反向連接，因此用BamHⅠ、HindⅢ兩種限制酶切割VP1基因和Ti質(zhì)粒，可以防止VP1基因、Ti質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接。由于普通農(nóng)桿菌中不含標(biāo)記基因，只有導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中含卡那霉素抗性基因，所以在培養(yǎng)基中添加卡那霉素可篩選出含有該目的基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌。

（4）VP1基因應(yīng)插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過(guò)轉(zhuǎn)化作用進(jìn)入番茄細(xì)胞并插入到染色體DNA上，使VP1基因能夠穩(wěn)定存在并發(fā)揮作用。

（5）VP1蛋白質(zhì)作為抗原注射到小鼠體內(nèi)，可引起小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，其結(jié)果可通過(guò)檢測(cè)豚鼠血液中產(chǎn)生的VP1蛋白的抗體數(shù)量來(lái)確定；為了使結(jié)果可信，應(yīng)設(shè)置注射生理鹽水的空白對(duì)照組。