Question

【題目】科研人員利用胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)對(duì)于擾素基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療，其技術(shù)流程如圖1：

(1)步驟①中，在核移植前應(yīng)去除卵母細(xì)胞的______________________，常用的導(dǎo)入目的基因的方法為______________________。

(2)將基因?qū)�入ES細(xì)胞而不是導(dǎo)入到上皮細(xì)胞是因?yàn)?/span>______________________。

(3)步驟③中，需要構(gòu)建含有干擾素基因的______________________。已知DNA分子復(fù)制過程中，子鏈延伸的方向是從5′端→3′端，構(gòu)建前利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，可以從圖2中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取______________________作為引物。對(duì)干擾素基因片段和質(zhì)粒進(jìn)行酶切時(shí)，可選用限制酶的組合為______________________。

(4)將步驟③獲得的ES細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，選擇發(fā)___________色熒光的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)。為檢測(cè)干擾素基因是否表達(dá)，可以采用______________________的方法。

Answer 1

【答案】細(xì)胞核 顯微注射法 ES細(xì)胞具有發(fā)育的全能性（或經(jīng)誘導(dǎo)可發(fā)育為各種組織、器官或細(xì)胞） 基因表達(dá)載體 B和C Hind Ⅲ和Pst Ⅰ（或EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ） 綠 抗原——抗體雜交

【解析】

本題以基因治療的流程圖為載體，考查了基因工程、細(xì)胞工程以及胚胎工程等方面的知識(shí)，難度適中�？忌�要能夠識(shí)記細(xì)胞核移植的過程；識(shí)記囊胚包括內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層兩部分；明確基因工程中質(zhì)粒和目的基因需要利用同種限制酶進(jìn)行切割；掌握目的基因檢測(cè)和鑒定的一般方法等。

分析圖1：圖示是利用胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）對(duì)干擾素基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療的流程，其中①表示通過核移植技術(shù)獲得重組胚胎的過程；②表示早期胚胎培養(yǎng)過程；③表示采用基因工程技術(shù)將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞的過程。

分析圖2：該DNA片段含有四種限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，其中SamⅠ酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)位于目的基因上。

分析圖3：圖3為質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，該質(zhì)粒含有2個(gè)標(biāo)記基因（紅色熒光標(biāo)記基因和綠色熒光標(biāo)記基因）。

(1)①表示通過核移植技術(shù)獲得重組胚胎的過程；核移植前要先用顯微操作的方法去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，并將第一極體也一并除去；導(dǎo)入目的基因進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞常用顯微注射法。

(2)從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的ES細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，可發(fā)育為各種組織、器官或細(xì)胞，所以將基因?qū)�入ES細(xì)胞。

（3）步驟③是將目的基因?qū)�入ES細(xì)胞，該過程之前需要構(gòu)建基因表達(dá)載體；DNA復(fù)制只能從5’到3’，因此構(gòu)建前利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，可以從圖2中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C作為引物。由圖可知，SamⅠ酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)位于目的基因上，用該酶切割會(huì)破壞目的基因，因此對(duì)干擾素基因片段和質(zhì)粒進(jìn)行酶切時(shí)，可選用限制酶HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ。
（4）用限制酶HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ切割時(shí)會(huì)破壞紅色熒光蛋白基因，但不會(huì)破壞綠色熒光蛋白基因，因此將步驟③獲得的ES細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，選擇發(fā)綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)。為檢測(cè)干擾素基因是否表達(dá)，可以采用抗原-抗體雜交法檢測(cè)目的基因是否翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。