Question

【題目】基因工程的相關(guān)技術(shù)可用于病毒檢測，也可用于制備疫苗。利用熒光PCR技術(shù)檢測是否感染某種RNA病毒時(shí)，基本操作流程為：提取病毒的RNA→熒光PCR擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄DNA→熒光檢測。請(qǐng)回答下列問題：

（1）分離病毒的RNA通常在冰浴條件下進(jìn)行，目的是抑制________________的活性，防止病毒的RNA降解。熒光PCR反應(yīng)體系中需要加入的酶和原料是________________。為保證反應(yīng)體系只擴(kuò)增病毒特異性核酸序列，應(yīng)先根據(jù)病毒的特異性核酸序列設(shè)計(jì)________________。

（2）熒光染料能摻入DNA雙鏈中發(fā)出熒光，在游離狀態(tài)下不發(fā)出熒光。若檢測到熒光量達(dá)到某個(gè)臨界值，則代表陽性，說明________________________________。若檢測出現(xiàn)“假陰性”現(xiàn)象，原因可能是________________________________。

（3）某病毒的E蛋白和P蛋白會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。構(gòu)建重組活病毒載體疫苗時(shí)，獲取某病毒的________________插入腺病毒的基因組中。通過重組腺病毒感染動(dòng)物可使其獲得免疫力，原因是________________________________________________。

Answer 1

【答案】RNA酶 反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶和4種脫氧核苷酸 2種引物 樣本中含有病毒的RNA 病毒的RNA在提取過程中發(fā)生降解 E基因和P基因 重組腺病毒在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)E蛋白和P蛋白，刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體和記憶細(xì)胞

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣.將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù).個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）RNA酶可以降解RNA，冰浴條件可以抑制RNA酶的活性防止RNA降解。熒光PCR可以利用RNA擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄DNA，需要的酶有反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶，原料是dNTP（dATP、dGTP dCTP、dTTP），樣液中可能含病毒的RNA，細(xì)胞自身的各種RNA等，為了保證反應(yīng)體系只擴(kuò)增病毒特異性核酸序列，應(yīng)先根據(jù)病毒的特異性核酸序列設(shè)計(jì)2種引物，確保只有病毒的特異性RNA可以擴(kuò)增，其他RNA不能擴(kuò)增。

（2）熒光染料能摻入DNA雙鏈中發(fā)出熒光，在游離狀態(tài)下不發(fā)出熒光。若檢測到熒光量達(dá)到某個(gè)臨界值，說明病毒的RNA在熒光PCR儀中擴(kuò)增，待測樣本中含有病毒的RNA，“假陰性”說明樣本中含有病毒的RNA，但是未擴(kuò)增到能檢測出的臨界值，可能原因是病毒的RNA在提取過程中發(fā)生降解，待測樣本中的病毒（核酸）量少。

（3）某病毒的E蛋白和P蛋白可引發(fā)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)，可以將獲取的病毒的E基因和P基因插入腺病毒的基因組中，重組腺病毒在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)E蛋白和P蛋白，刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體和記憶細(xì)胞，使動(dòng)物獲得免疫力。