Question

12．探究如何從土壤中分離自生固態(tài)氮菌與計(jì)數(shù)．實(shí)驗(yàn)原理：農(nóng)田的表層土壤中，自生固氮菌的含量比較多．將用表土制成的稀泥漿，接種到無(wú)氮培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)．在這種情況下，只有自生固氮菌才能生長(zhǎng)繁殖．用這種方法，可以將自生固氮菌與其他細(xì)菌分離開(kāi)來(lái)．
材料用具：農(nóng)田的表層土壤、無(wú)氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、盛9mL無(wú)菌水的試管、無(wú)菌吸管、無(wú)菌涂布器、無(wú)菌培養(yǎng)皿、盛90mL無(wú)菌水的錐形瓶、恒溫箱．
方法步驟：
（1）倒平板：分別將無(wú)氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板，應(yīng)在酒精燈火焰旁操作．
（2）制備土壤稀釋液：取土樣10g加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻．用無(wú)菌吸管吸取上清液lmL，轉(zhuǎn)至9mL的無(wú)菌水的大試管中，依次稀釋到10⁷倍稀釋度．
（3）涂布：按照由101～108倍稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布，每個(gè)稀釋度下，無(wú)氮培養(yǎng)基應(yīng)至少涂布3個(gè)子板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布1個(gè)．
（4）培養(yǎng)：放入恒溫箱內(nèi)，在28～30℃下培養(yǎng)3～4d．
（5）細(xì)菌的計(jì)數(shù)：培育過(guò)程中，每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取茵落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)．
（6）預(yù)期結(jié)果：相同稀釋度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落數(shù)多于（填“多于”或“少于”）無(wú)氮培養(yǎng)基上的數(shù)目，原因是無(wú)氮培養(yǎng)基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上幾乎允許土壤中所有菌類(lèi)的生存．

Answer 1

分析 1．分離菌株的思路
（1）自然界中目的菌株的篩選
①依據(jù)：根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找．
②實(shí)例：PCR技術(shù)過(guò)程中用到的耐高溫的Taq DNA聚合酶，就是從熱泉中篩選出來(lái)的Taq細(xì)菌中提取出來(lái)的．
（2）實(shí)驗(yàn)室中目的菌株的篩選
①原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度．pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)．
培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理：培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源．缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物
②方法：能合成脲酶的細(xì)菌才能分解尿素．配制以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌就是能分解尿素的細(xì)菌
2．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法
（1）稀釋涂布平板法（間接）
①當(dāng)樣品的稀釋庋足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌．
②通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)來(lái)推測(cè)樣品中大約含有的活菌數(shù)．
（2）利用顯微鏡直接計(jì)數(shù)
3．分解尿素的細(xì)菌的鑒定細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)．在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變紅，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素．
4．實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣→樣品的稀釋→將稀釋液涂布到以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上→挑選能生長(zhǎng)的菌落→鑒定．

解答 解：（1）倒平板應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行，防止雜菌污染．
（3）按照由10¹～10⁸倍稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布，每個(gè)稀釋度下，無(wú)氮培養(yǎng)基應(yīng)至少涂布3個(gè)平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布1個(gè)平板做對(duì)照．
（5）培育過(guò)程中，每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取茵落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)．
（6）肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照，以消除無(wú)關(guān)變量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，該培養(yǎng)基適合其他細(xì)菌生存，所以，它比無(wú)氮培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目多．
故答案為：
（1）酒精燈火焰旁
（3）3      1
（5）菌落數(shù)目穩(wěn)定         30～300  
（6）多于　 無(wú)氮培養(yǎng)基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上幾乎允許土壤中所有菌類(lèi)的生存

點(diǎn)評(píng) 本題通過(guò)探究實(shí)驗(yàn)的過(guò)程考查微生物的培養(yǎng)、分離和計(jì)數(shù)等知識(shí)點(diǎn)，要求考生識(shí)記接種微生物常用的兩種方法及相關(guān)操作；掌握微生物的計(jì)數(shù)方法，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確答題，難度適中．