Question

【題目】抗菌肽具有熱穩(wěn)定性以及廣譜抗細(xì)菌等特點(diǎn)，其廣泛的生物學(xué)活性顯示了在醫(yī)學(xué)上良好的應(yīng)用前景�？蒲泄ぷ髡邔⑷舾删幋a抗菌肽（ABP）序列按照首尾相連的方式插在質(zhì)粒PLG339的布康唑抗性基因內(nèi)部，形成長度為4800bp（1bp為一個堿基對）的重組質(zhì)粒PLG339-nABP，相關(guān)過程如圖所示。已知重組質(zhì)粒中，每個編碼ABP序列中都含有限制酶AccⅢ的一個切點(diǎn)，基因trpA的表達(dá)產(chǎn)物可使細(xì)胞利用無機(jī)氮源合成色氨酸（色氨酸是微生物生長必須的氨基酸）。請據(jù)圖回答下列問題：

（1）質(zhì)粒PLG339的基本單位是______。

（2）若PLG339-nABP經(jīng)限制酶AccⅢ處理后，產(chǎn)生66bp和4140bp兩種長度的DNA片段，單個抗菌肽（ABP）最多由______個氨基酸構(gòu)成（不考慮終止密碼）。

（3）現(xiàn)有大腸桿菌和酵母菌兩種菌群，可作為導(dǎo)入PLG339-nABP的受體細(xì)胞是______，理由是______。

（4）若選定的受體細(xì)胞為trpA基因缺陷型，則需采用兩步法篩選含重組質(zhì)粒的細(xì)胞。第一步篩選的固體培養(yǎng)基在營養(yǎng)成分上的要求是：______，不含色氨酸；第二步采用“影印法”，將第一步所得菌落轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中應(yīng)添加______。通過對照，最終選出能在第一步培養(yǎng)基上生長，而不能在第二步培養(yǎng)基上生長的菌落即為符合要求的成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞。

（5）在測試轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物ABP對金黃色葡萄球菌的殺菌效果時獲得了如圖所示的結(jié)果，據(jù)此可獲得的結(jié)論是：ABP抑菌效果與ABP的______和金黃色葡萄球菌的______有關(guān)。

Answer 1

【答案】脫氧核苷酸 22 酵母菌 抗菌肽能夠殺滅細(xì)菌（不能殺滅酵母菌） 含無機(jī)氮源 布康唑 濃度 不同培養(yǎng)時期

【解析】

基因工程的操作步驟：獲取目的基因（基因文庫獲取、PCR擴(kuò)增、人工合成）；構(gòu)建基因表達(dá)載體（含目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)）；把目的基因?qū)�入受體細(xì)胞（動物細(xì)胞—常用顯微注射法，植物細(xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，微生物細(xì)胞常用鈣離子處理法）；目的基因的檢測與鑒定（DNA分子雜交、分子雜交、抗原抗體雜交及個體水平的檢測等）。

（1）質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)是原核生物細(xì)胞質(zhì)中小型環(huán)狀的DNA分子，故質(zhì)粒PLG339的基本單位是脫氧核苷酸。

（2）若PLG339-nABP經(jīng)限制酶AccⅢ處理后，產(chǎn)生66bp和4140bp兩種長度的DNA片段，根據(jù)題干知，編碼抗菌肽（ABP）序列的基因按照首尾相連的方式插在質(zhì)粒PLG339的布康唑抗性基因內(nèi)部，故切割后66bp的應(yīng)為目的基因片段，目的基因是編碼蛋白質(zhì)的序列，轉(zhuǎn)錄形成66個堿基的mRNA，mRNA上三個相鄰的堿基編碼一個氨基酸，故單個抗菌肽（ABP）最多由66÷3=22個氨基酸。

（3）根據(jù)題干：抗菌肽具有熱穩(wěn)定性以及廣譜抗細(xì)菌等特點(diǎn)，抗菌肽能夠殺滅細(xì)菌（不能殺滅酵母菌），故應(yīng)選用酵母菌作為導(dǎo)入PLG339-nABP的受體細(xì)胞。

（4）由于基因trpA的表達(dá)產(chǎn)物可使細(xì)胞利用無機(jī)氮源合成色氨酸，故進(jìn)行篩選時根據(jù)可以先在含無機(jī)氮源，不含色氨酸的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，受體細(xì)胞為trpA基因缺陷型，能生長的受體細(xì)胞即導(dǎo)入了質(zhì)粒，但不一定是重組質(zhì)粒，還需要進(jìn)行第二步篩選；由于目的基因編碼抗菌肽（ABP）序列插入到布康唑抗性基因內(nèi)部，故導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞不抗布康唑，將第一步所得菌落轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加布康唑，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的應(yīng)在第一步培養(yǎng)基上能生長，而不能在第二步培養(yǎng)基上生長的菌落。

（5）據(jù)圖分析可知：轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物ABP對金黃色葡萄球菌的殺菌效果與之前的透明圈相比，比值越小抑菌效果越好，比值不同可能與圖中浸的ABP濃度不同有關(guān)，培養(yǎng)不同天數(shù)抑菌效果不同，故還與不同培養(yǎng)時期有關(guān)。