Question

16．井岡霉素是我國目前防治水稻紋枯病的主導(dǎo)農(nóng)藥，由于多年的單一使用，部分地區(qū)紋枯病菌對其產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，迫切需要研發(fā)有類似效果的新型替代生物農(nóng)藥．從細(xì)菌M18中提取的申嗪霉素能有效抑制水稻紋枯菌，與其它農(nóng)藥相比對人體和動物安全性高．為了開發(fā)更穩(wěn)定、高產(chǎn)的新型菌株，科研人員進(jìn)行了以下研究．請回答下列問題：
（1）篩選菌株選擇健康（健康/患紋枯�。┑乃�稻植株的根切成小段放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，取適量培養(yǎng)液涂布于瓊脂平板上，培養(yǎng)5天后，挑選形態(tài)不同的單菌落，對其進(jìn)行編號．然后挑取少許菌株分別接種于長滿水稻紋枯菌的瓊脂平板上，培養(yǎng)3天后，觀察紋枯菌的生長，根據(jù)抑菌圈的大小選出編號為P12的理想菌株．
（2）鑒定菌株P(guān)12所屬的細(xì)菌類型提取P12基因組DNA，擴(kuò)增其16S rDNA（能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異），擴(kuò)增過程需要的酶有DNA聚合酶，還需要特定的引物．對其測序后確定該菌株所屬細(xì)菌類型．
（3）檢測P12的細(xì)胞毒性
用人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為指示株系，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．通入的空氣應(yīng)含5%的二氧化碳，培養(yǎng)液中含少量胎牛血清，目的是補(bǔ)充細(xì)胞生長所需的未知營養(yǎng)物質(zhì)．2h后分別將相同濃度的P12、M18和DH5α（人體腸道內(nèi)共生的大腸桿菌）菌液5μL加入A549細(xì)胞培養(yǎng)液中，4h后測定吸光值，以表示乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量．LDH是活細(xì)胞內(nèi)含有的酶，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)菌攻擊時(shí)，細(xì)胞膜的通透性改變，LDH釋放至細(xì)胞外．測定結(jié)果顯示，P12對A549細(xì)胞的毒性略低于菌株M18，顯著高于大腸桿菌DH5α．
（4）部分地區(qū)的紋枯菌對井岡霉素產(chǎn)生抗藥性的原因，是由于井岡霉素對細(xì)菌進(jìn)行長期的選擇，使細(xì)菌的耐藥性基因頻率發(fā)生了改變的結(jié)果．

Answer 1

分析 篩選P12的理想菌株需要使用選擇培養(yǎng)基，根據(jù)抑菌圈的大小確定目的菌株釋放符合要求．PCR計(jì)數(shù)需要DNA聚合酶和特定的引物．據(jù)圖分析：M18對A549細(xì)胞的毒性最大，其次是P12，最低的是大腸桿菌DH5α．據(jù)此分析作答．

解答 解：（1）題干所述篩選目的菌株時(shí)需要選擇健康的水稻植株的根切成小段放入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，經(jīng)過稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)后，挑選形態(tài)不同的單菌落，進(jìn)行編號．接著挑取少許菌株分別接種于長滿水稻紋枯菌的瓊脂平板上，培養(yǎng)3天后，觀察紋枯菌的生長，培養(yǎng)后抑菌圈越大，抑菌效果越好，故根據(jù)抑菌圈的大小抑菌圈的大小選出編號為P12的理想菌株．
（2）基因擴(kuò)增過程需要的酶有DNA聚合酶，另外還需要特定的引物．
（3）用人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行有氧呼吸，為模擬人肺中的環(huán)境，所以需要通入的空氣應(yīng)含5%的二氧化碳，培養(yǎng)液中含少量胎牛血清，以補(bǔ)充細(xì)胞生長所需的未知營養(yǎng)物質(zhì)．當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)菌攻擊時(shí)，細(xì)胞膜的通透性改變，LDH釋放至細(xì)胞外．據(jù)圖分析，M18對A549細(xì)胞的毒性最大，其次是P12，最低的是大腸桿菌DH5α．
（4）由于藥物井岡霉素對紋枯菌進(jìn)行長期選擇，使細(xì)菌的耐藥性基因頻率發(fā)生改變，所以產(chǎn)生了抗藥性．
故答案為：
（1）健康    單菌落     抑菌圈的大小
（2）DNA聚合酶   引物 
（3）5%的二氧化碳     補(bǔ)充細(xì)胞生長所需的未知營養(yǎng)物質(zhì)   通透性   略低于菌株M18，顯著高于大腸桿菌DH5α
（4）井岡霉素    耐藥性基因頻率

點(diǎn)評 本題結(jié)合圖示主要考查微生物的篩選與分離、PCR技術(shù)等知識，意在強(qiáng)化學(xué)生對生物技術(shù)實(shí)踐中的相關(guān)知識的理解與運(yùn)用．