Question

【題目】人類胰島素基因位于第11號(hào)染色體上，長(zhǎng)度8416bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，人類胰島素的氨基酸序列已知�；卮鹣嚓P(guān)問(wèn)題：

（1）上圖是利用PCR技術(shù)獲取人胰島素基因的方法，除了此方法外，還可以利用的方法是____________。

（2）利用PCR技術(shù)獲取人胰島素基因，在緩沖液中除了要添加模板和引物外，還需要添加的物質(zhì)有______________________________。

（3）經(jīng)過(guò)______輪循環(huán)可以得到所需的目的基因，一個(gè)DNA分子經(jīng)過(guò)5輪循環(huán)，需要引物A______個(gè)，從PCR的過(guò)程和DNA分子的特點(diǎn)，試著寫(xiě)出設(shè)計(jì)引物需要注意的問(wèn)題____________（答出2點(diǎn)即可）。

（4）利用SDS-凝膠電泳分離不同DNA分子，遷移速度取決于__________________。

（5）利用圖示方法獲取的目的基因，直接構(gòu)建基因表達(dá)載體后導(dǎo)入大腸桿菌，能不能表達(dá)出人胰島素，判斷并說(shuō)明理由______________________________。

Answer 1

【答案】從基因文庫(kù)獲取或人工合成 四種脫氧核昔酸和熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶） 3 31 引物自身不能有互補(bǔ)序列 引物之間不能有互補(bǔ)序列 引物長(zhǎng)度適當(dāng)

引物能與目的基因兩側(cè)特異性結(jié)合 避免與擴(kuò)增DNA內(nèi)有過(guò)多互補(bǔ)的序列 DNA分子的大小 不能，因?yàn)榇朔椒ǐ@得的目的基因中含有內(nèi)含子，大腸桿菌無(wú)法正常識(shí)別內(nèi)含子而對(duì)內(nèi)含子部分轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行翻譯，導(dǎo)致合成的蛋白質(zhì)出現(xiàn)錯(cuò)誤

【解析】

1、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲�。�2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。2、采用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過(guò)程為：變性、退火、延伸。3、PCR技術(shù)的原理是模擬生物體內(nèi)DNA分子復(fù)制的過(guò)程，利用DNA分子熱變形原理，通過(guò)控制溫度控制控制DNA分子的解聚和結(jié)合，DNA分子體內(nèi)復(fù)制過(guò)程DNA的解旋是在解旋酶的作用下實(shí)現(xiàn)的；PCR擴(kuò)增DNA片段過(guò)程最高經(jīng)過(guò)n次擴(kuò)增，形成的DNA分子數(shù)是2n個(gè)，其中只有2條單鏈不含有引物。

（1）獲取目的基因的方法包括利用PCR技術(shù)擴(kuò)增、從基因文庫(kù)中獲取和人工合成等。

（2）用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)所需的條件：引物、模板DNA（目的基因或A基因）、原料（4種脫氧核糖核苷酸）和耐熱性的DNA聚合酶等。

（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，此技術(shù)的前提是具有一段已知目的基因的核苷酸序列。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過(guò)程為：變性、退火、延伸。根據(jù)PCR過(guò)程的特點(diǎn)可知，第一、二輪循環(huán)合成的子鏈長(zhǎng)度均不同，根據(jù)半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的四個(gè)DNA分子的兩條鏈均不等長(zhǎng)，第三輪循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子存在等長(zhǎng)的兩條核苷酸鏈，即僅含引物之間的序列，因此，經(jīng)過(guò)3輪循環(huán)可以得到所需的目的基因。所以循環(huán)5次，理論上至少需要26-2=62個(gè)引物，其中A引物31個(gè)。引物設(shè)計(jì)時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)：引物自身不能有互補(bǔ)序列；引物之間不能有互補(bǔ)序列；引物長(zhǎng)度適當(dāng)；引物能與目的基因兩側(cè)特異性結(jié)合；避免與擴(kuò)增DNA內(nèi)有過(guò)多互補(bǔ)的序列。

（4）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)中分子的遷移速率主要取決于分子的大小，因此利用SDS-凝膠電泳分離不同DNA分子，遷移速度取決于DNA分子的大小。

（5）題干信息顯示圖示獲取的目的基因含有外顯子和內(nèi)含子，因此直接將含有此目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌并不能表達(dá)出胰島素，原因是大腸桿菌無(wú)法正常識(shí)別內(nèi)含子而對(duì)內(nèi)含子部分轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行翻譯，導(dǎo)致合成的蛋白質(zhì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。