Question

13．圖甲表示某細(xì)菌的質(zhì)粒中相關(guān)限制酶的切割位點，圖乙表示目的基因所在的DNA中相關(guān)限制酶的切割位點．請分析并回答下列問題：

（1）用SmaⅠ限制酶處理圖甲所示的質(zhì)粒會得到2個DNA片段，用AluⅠ處理圖乙所示的外源DNA會增加2個游離的磷酸基團(tuán)．
（2）為了避免目的基因和質(zhì)粒在酶切后產(chǎn)生的片段發(fā)生自身環(huán)化或任意連接，以及便于篩選需要，在實際操作中，一般應(yīng)選用PstⅠ和HindⅢ酶（填限制酶名稱）同時酶切質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA．再用DNA連接酶處理．如果是用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，設(shè)計引物是關(guān)鍵，但在擴(kuò)增時退火溫度一般為55～60℃，對于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%時一般用60℃，原因是G與C（之間是三個氫鍵）比例越高越穩(wěn)定[或A與T（之間是兩個氫鍵）比例越高越不穩(wěn)定]．
（3）為了篩選獲得含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，實驗人員首先將經(jīng)轉(zhuǎn)化處理過的大腸桿菌接種在含四環(huán)素（抗生素）的培養(yǎng)基中，然后用影印法將該培養(yǎng)基上的菌落按原來的方向印在含氯霉素（抗生素）培養(yǎng)基上，以篩選獲得含重組質(zhì)粒的細(xì)菌．在含四環(huán)素培養(yǎng)基中能生長繁殖，而在含氯霉素培養(yǎng)基中不能生長繁殖的是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒（或目的基因）的大腸桿菌．

（4）經(jīng)檢測：在上述導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，目的基因正常轉(zhuǎn)錄形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白質(zhì)卻并不具有生物活性，最可能的原因是大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體（或大腸桿菌缺乏生物膜系統(tǒng)），不能對多肽鏈進(jìn)行折疊、組裝與修飾．

Answer 1

分析 分析題圖：外源DNA含有四個酶切位點，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位點位于目的基因上，所以不能用此酶切割；質(zhì)粒也含有SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶的酶切位點，但用SmaⅠ酶切割會將質(zhì)粒上兩個標(biāo)記基因均破壞，所以不能用SmaⅠ酶切割；所以構(gòu)建基因表達(dá)載體時，應(yīng)選用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA．用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質(zhì)粒，會破壞氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環(huán)素抗性基因，所以導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗四環(huán)素，但不能抗癌變青霉素．

解答 解：（1）質(zhì)粒上含有兩個SmaⅠ限制酶的切割位點，所以用SmaⅠ限制酶處理圖甲所示的質(zhì)粒會得到2個DNA片段；圖乙所示的外源DNA含有一個AluⅠ限制酶的切割位點，所以用AluⅠ處理外源DNA會形成兩個黏性末端，增加2個游離的磷酸基團(tuán)．
（2）外源DNA含有四個酶切位點，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位點位于目的基因上，所以不能用此酶切割；用SmaⅠ酶切割會將質(zhì)粒上兩個標(biāo)記基因均破壞，所以不能用SmaⅠ酶切割；應(yīng)選用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA，這樣可以避免目的基因和質(zhì)粒在酶切后產(chǎn)生的片段發(fā)生自身環(huán)化或任意連接，也便于篩選需要．如果是用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，設(shè)計引物是關(guān)鍵，但在擴(kuò)增時退火溫度一般為55～60℃，對于（A+T）%＞50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%時一般用60℃，原因是G與C之間是三個氫鍵，所以C和G比例越高，DNA越穩(wěn)定．
（3）用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質(zhì)粒，會破壞氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環(huán)素抗性基因，所以導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗四環(huán)素，但不能抗癌變青霉素．為了篩選獲得含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，首先將經(jīng)轉(zhuǎn)化處理過的大腸桿菌接種在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，然后用影印法將該培養(yǎng)基上的菌落按原來的方向印在含氯霉素培養(yǎng)基上，以篩選獲得含重組質(zhì)粒的細(xì)菌．在含四環(huán)素培養(yǎng)基中能生長繁殖，而在含氯霉素培養(yǎng)基中不能生長繁殖的是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌．
（4）因為大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體，不能對多肽鏈進(jìn)行折疊、組裝與修飾，所以在上述導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，目的基因正常轉(zhuǎn)錄形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白質(zhì)卻并不具有生物活性．
故答案為：
（1）2    2
（2）PstⅠ和HindⅢ酶      G與C（之間是三個氫鍵）比例越高越穩(wěn)定[或A與T（之間是兩個氫鍵）比例越高越不穩(wěn)定]
（3）四環(huán)素    氯霉素    重組質(zhì)粒（或 目的基因）
（4）大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體（或大腸桿菌缺乏生物膜系統(tǒng)），不能對多肽鏈進(jìn)行折疊、組裝與修飾

點評 本題以圖為載體，考查基因工程的相關(guān)知識，意在考查考生分析題圖提取有效信息的能力；理解限制酶的作用特點，并結(jié)合圖解分析限制酶的作用結(jié)果；能運用所學(xué)知識，對生物學(xué)問題作出準(zhǔn)確判斷和得出正確結(jié)論的能力．