Question

【題目】CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)是近年來(lái)頗受關(guān)注的一項(xiàng)新技術(shù)。該基因表達(dá)系統(tǒng)主要包含引導(dǎo)RNA和Cas9蛋白兩個(gè)部分，引導(dǎo)RNA能識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因序列的編輯。研究人員試圖用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻產(chǎn)量基因Q基因進(jìn)行編輯，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9僅存在于原核生物，故需借助____________技術(shù)才能在水稻細(xì)胞中發(fā)揮作用。Cas9蛋白與_____________酶的功能相似。

（2）首先依據(jù)___________的部分序列設(shè)計(jì)DNA片段A（負(fù)責(zé)編碼相應(yīng)引導(dǎo)RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質(zhì)粒B連接，以構(gòu)建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達(dá)載體（如圖所示）。位點(diǎn)Ⅰ、位點(diǎn)Ⅱ分別表示_____________酶切位點(diǎn)。

（3）質(zhì)粒B大小為2.5kb（位點(diǎn)Ⅰ與位點(diǎn)Ⅱ相隔60b），經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5kb（千堿基對(duì)），連接形成的表達(dá)載體大小為___________kb。

（4）常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入水稻受體細(xì)胞，依據(jù)農(nóng)桿菌的侵染特點(diǎn)，目的基因?qū)⒉迦氲絋i質(zhì)粒的_______上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化作用，進(jìn)入水稻細(xì)胞，并將其插入到____________，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達(dá)。

（5）CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)有時(shí)存在編輯對(duì)象出錯(cuò)而造成脫靶，試從引導(dǎo)RNA的角度分析脫靶的原因_________________________________________________。

Answer 1

【答案】轉(zhuǎn)基因（DNA重組或基因工程） 限制酶 Q基因 KpnⅠ、BamHⅠ 2.94kb T-DNA 水稻細(xì)胞染色體的DNA上 其他DNA序列也含有與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)配對(duì)的序列，造成引導(dǎo)RNA錯(cuò)誤結(jié)合而脫靶

【解析】

根據(jù)題意分析可知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)是利用該基因表達(dá)系統(tǒng)中的引導(dǎo)RNA能識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因序列的編輯。由于其他DNA序列也含有與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)配對(duì)的序列，造成引導(dǎo)RNA錯(cuò)誤結(jié)合而出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中是利用了T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到受體細(xì)胞染色體DNA分子上。

（1）若將原核生物的基因?qū)�入真核生物中并表達(dá)，需要利用基因工程技術(shù)。根據(jù)題干信息“Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA”，說(shuō)明Cas9蛋白與限制酶的功能相似。

（2）由于是對(duì)水稻產(chǎn)量基因Q基因進(jìn)行編輯，故首先需要依據(jù)Q基因的部分序列設(shè)計(jì)DNA片段A（負(fù)責(zé)編碼相應(yīng)引導(dǎo)RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質(zhì)粒B連接，以構(gòu)建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達(dá)載體（如圖所示）。根據(jù)片段A兩端的限制酶種類(lèi)以及片段A連接在位點(diǎn)Ⅰ、位點(diǎn)Ⅱ之間，可知位點(diǎn)Ⅰ、位點(diǎn)Ⅱ分別表示KpnⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。

（3）質(zhì)粒B大小為2.5kb（位點(diǎn)Ⅰ與位點(diǎn)Ⅱ相隔60b），經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5kb（千堿基對(duì)），連接形成的表達(dá)載體大小為2.5+0.5-0.06=2.94kb。

（4）常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入水稻受體細(xì)胞，由于農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，故可將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化作用，進(jìn)入水稻細(xì)胞，并將其插入到水稻細(xì)胞染色體的DNA上，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達(dá)。

（5）由于其他DNA序列也含有與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)配對(duì)的序列，造成引導(dǎo)RNA錯(cuò)誤結(jié)合，從而導(dǎo)致CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)會(huì)出現(xiàn)編輯對(duì)象出錯(cuò)而造成脫靶。