Question

4．科研人員通過基因工程實現(xiàn)了β-甘露聚糖酶基因在豬腸道野生酵母菌中的表達，使原來不能被豬利用的粗纖維在豬腸道內(nèi)被分解成可直接吸收的單糖．如圖為構建工程菌的部分過程，其中介導序列能引導載體整合到酵母菌的染色體DNA上．請回答：

限制酶	識別序列和切割位點
EcoRⅠ	↓ GAATTC
BamHⅠ	↓ GGATCC
BglⅡ	↓ AGATCT
SalⅠ	↓ GTCGAC

（1）①過程中需要的工具酶是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，②③過程中需要的工具酶是（限制酶和）DNA連接酶．
（2）同尾酶是指切割DNA分子后能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶，圖中4種限制酶中屬于同尾酶的是BamHⅠ和BglⅡ．
（3）重組表達載體中的介導序列引導目的基因整合到酵母菌的染色體DNA上，其意義在于使目的基因能隨工程菌染色體穩(wěn)定遺傳和表達．
（4）①過程從野生酵母菌染色體DNA中PCR擴增介導序列時，科研人員設計了如下一對引物：和 ，其中下劃線部分序列的設計依據(jù)是介導序列兩端的部分DNA序列，方框部分序列的設計目的是使擴增出的介導序列兩端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列．
（5）對重組表達載體進行酶切鑒定，假設所用的酶均可將識別位點完全切開．若使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，得到3種DNA片斷．若使用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，得到2種DNA片斷．

Answer 1

分析 分析題圖：圖示為構建工程菌的部分過程，其中①表示采用PCR技術擴增介導序列的過程；②是用DNA連接酶將質粒載體與介導序列連接形成重組質粒的過程；③表示用DNA連接酶將質粒載體、介導序列質粒載體和克隆載體重新組成形成重組表達載體．

解答 解：（1）圖中①表示采用PCR技術擴增介導序列的過程，該過程在高溫條件下進行，需要熱穩(wěn)定性DNA聚合酶；②③表示基因表達載體的構建過程，除了圖中的限制酶外，該過程中還需要DNA連接酶．
（2）表中限制酶BamHⅠ和BglⅡ的識別序列不同，但兩者切割產(chǎn)生的黏性末端相同，屬于同尾酶．
（3）轉基因生物染色體的DNA上是否插入目的基因是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關鍵．重組表達載體中的介導序列引導目的基因整合到酵母菌的染色體DNA上，這可使目的基因能隨工程菌染色體穩(wěn)定遺傳和表達．
（4）①過程從野生酵母菌染色體DNA中PCR擴增介導序列時，科研人員設計了如下一對引物：GAATTCGACCTCAAATCAGGTAGG和TTGCATTGACTTACACCTAGG，引物是根據(jù)已知核苷酸序列設計的，因此其中下劃線部分序列的設計依據(jù)是介導序列兩端的部分DNA序列；GAATTC是限制酶EcoRⅠ的識別序列，而CCTAGG是限制酶BamHⅠ的識別序列，因此方框部分序列的設計目的是使擴增出的介導序列兩端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列．
（5）由圖可知，重組的基因表達載體含有2個EcoRⅠ酶割位點，含有1個SalⅠ酶切位點，因此使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切重組質粒可以得到3種DNA片斷．重組的基因表達載體含有2個EcoRⅠ酶割位點，但不再含有BamHⅠ酶割位點，因此用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重組質�？梢缘玫�2種DNA片斷．
故答案為：
（1）熱穩(wěn)定性DNA聚合酶（Taq酶或耐高溫的DNA聚合酶）  （限制酶和）DNA連接酶
（2）BamHⅠ和BglⅡ
（3）使目的基因能隨工程菌染色體穩(wěn)定遺傳和表達
（4）介導序列兩端的部分DNA序列    使擴增出的介導序列兩端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列
（5）3    2

點評 本題結合構建工程菌的部分過程圖解，考查基因工程的技術和原理，要求考生識記基因工程的工具和操作步驟，能根據(jù)圖中和表中信息答題．需要注意的是第（5）題，考生可以將重組表達載體上的酶切位點標出，明確BamHⅠ和BglⅡ切割后的黏性末端能在DNA連接酶的作用下連接起來，但重組序列不能被BamHⅠ或BglⅡ酶割．