Question

12．科學(xué)家將魚抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相對寒冷的環(huán)境中生長．質(zhì)粒上有PstI、SmaI、HindⅢ、AluI等四種限制酶切割位點(diǎn)．如圖是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程的示意圖（ampr為抗氨芐青霉素基因），其中①～④是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程中的相關(guān)步驟，I、Ⅱ表示相關(guān)結(jié)構(gòu)或細(xì)胞．請據(jù)圖作答：

（1）基因工程的核心步驟是構(gòu)建基因表達(dá)載體，在該步驟中，可用一種或多種限制 酶進(jìn)行切割．為了避免目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，在此實(shí)例中，應(yīng)該選用限制酶PstI、SmaI，分別對含魚抗凍蛋白基因的DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割，切割后產(chǎn)生的DNA片段分別為4種和2種．
（2）培養(yǎng)基中的氨芐青霉素會抑制番茄愈傷組織細(xì)胞的生長，欲利用該培養(yǎng)基篩選已導(dǎo)入含魚的抗凍蛋白基因的番茄細(xì)胞，應(yīng)使基因表達(dá)載體 I中含有抗氨芐青霉素基因（ampr），作為標(biāo)記基因．除上述目的基因和標(biāo)記基因外，基因表達(dá)載體 I中還應(yīng)有啟動(dòng)子、終止子和復(fù)制原點(diǎn)．
（3）研究人員通常采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（或基因槍法等） 法將魚抗凍蛋白基因?qū)�入番茄�?xì)胞內(nèi)．通常采用抗原--抗體雜交技術(shù)，在分子水平檢測目的基因是否翻譯形成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)．

Answer 1

分析 分析圖解：魚的抗凍蛋白基因上具有三種限制酶切割位點(diǎn)，PstⅠ酶的切割位點(diǎn)存在于目的基因的兩側(cè)，SmaⅠ酶的切割位點(diǎn)存在于目的基因的左側(cè)，而AluⅠ酶的切割位點(diǎn)存在于目的基因的中央，因此不宜選用AluⅠ酶．質(zhì)粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四種限制酶切割位點(diǎn)，在選擇限制酶時(shí)一般選擇同種限制酶，以便形成相同的黏性末端．圖中①～④分別表示：基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、脫分化、再分化．

解答 解：（1）基因工程的核心步驟是構(gòu)建基因表達(dá)載體；在構(gòu)建基因表達(dá)載體中，如果目的基因和載體用同一種限制酶切割，獲得的黏性末端相同，將會發(fā)生自身環(huán)化現(xiàn)象，故應(yīng)選用不同的限制酶分別對目的基因和載體切割，以獲得不同的黏性末端，故應(yīng)選用PstⅠ和SmaⅠ對含魚抗凍蛋白基因的DNA、質(zhì)粒進(jìn)行切割，PstⅠ和SmaⅠ在魚抗凍蛋白基因的DNA上共有3個(gè)酶切位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生4個(gè)DNA片段，而環(huán)狀質(zhì)粒上有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生2個(gè)DNA片段．
（2）能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中細(xì)胞具有抗氨芐青霉素基因，故基因表達(dá)載體Ⅰ中應(yīng)含有抗氨芐青霉素基因作為標(biāo)記基因．基因表達(dá)載體的組成包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法．在分子水平檢測目的基因是否翻譯形成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)，通常采用抗原-抗體雜交技術(shù)．
故答案為：
（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體   PstI、SmaI    含魚抗凍蛋白基因的DNA和質(zhì)粒     4    2
（2）抗氨芐青霉素基因（ampr）    啟動(dòng)子    終止子
（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（或基因槍法等）     抗原--抗體雜交

點(diǎn)評 本題具有一定的難度，屬于考綱中理解層次的要求，考查了基因工程的工具酶、目的基因?qū)�入受體細(xì)胞以及利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)知識，解答的難點(diǎn)是能夠根據(jù)目的基因和質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)選擇合適的限制酶．