Question

4．1994年，科研人員發(fā)現(xiàn)一株擬南芥突變株，由于NPR1基因突變，使其系統(tǒng)獲得性抗性相關蛋白基因的應答性表達被徹底破壞，后來采用定位克隆技術從擬南芥中克隆到了NPR1基因，發(fā)現(xiàn)它的表達與植物抗細菌和真菌毒性提高有關．以NPR1基因作為目的基因可人工獲得抗性植株．請回答：
（1）抗性相關蛋白基因的應答性表達過程包括轉錄和翻譯兩個步驟．從野生擬南芥中分離出NPR1基因的mRNA后，以其為模板可逆轉錄出目的片段，然后用PCR技術可實現(xiàn)目的片段的克�。�與生物體內(nèi)的DNA復制相比，PCR技術的特殊之處有離體條件、需要高溫或高溫酶（答出兩項）等．
（2）由于DNA復制時，子鏈只能由5'向3'方向延伸，故利用PCR擴增NPR1基因時，可以從圖1的A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C作為引物．PCR擴增進行50個循環(huán)后，理論上可以產(chǎn)生約為2⁵⁰個DNA分子，將這些DNA分子與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做擬南芥的cDNA文庫（或部分基因文庫），擴增獲得的目的基因與擬南芥細胞中該基因堿基序列不同（填“相同”或“不同”）．

（3）將人工合成的NPR1基因導入普通植物之前，需要構建含有NPR1基因的基因表達載體．對NPR1基因片段和質粒（圖2所示）進行酶切時，可選用限制酶的組合為HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ．

Answer 1

分析 1、基因工程又叫DNA重組技術，是指按照人們的意愿，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品．
2、基因工程的工具：
（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂．
（2）DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵．
（3）運載體：常用的運載體：質粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒．
3、PCR技術擴增目的基因
（1）原理：DNA雙鏈復制
（2）過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成．
4、根據(jù)圖1、2顯示：SmaI切割位點在綠色熒光蛋白基因上并會破壞NPR1基因，不能使用SmaI．又因為在NPR1基因左端只有PstI一種酶的切割位點，在右側有HindIII、EcoRI2個切割位點，因此對NPR1基因片段和質粒（圖2所示）進行酶切時，可選用限制酶的組合為HindⅢ和PstI或EcoRⅠ和Pst．

解答 解：（1）基因表達過程包括轉錄和翻譯兩個步驟．以mRNA為模板，通過逆轉錄產(chǎn)生單鏈DNA，再進一步產(chǎn)生雙鏈DNA，即目的基因片段．PCR技術與生物體內(nèi)的DNA復制相比，PCR技術的特殊之處有：離體條件、需要高溫或高溫酶等．
（2）DNA分子兩條鏈是反向平行的關系，又因為DNA復制時子鏈只能由5'向3'方向延伸，因此A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C作為引物．PCR擴增以2ⁿ形式擴增，進行50個循環(huán)后，理論上可以產(chǎn)生約為2⁵⁰個DNA分子．這些DNA只是某生物體部分DNA，因此將這些DNA分子與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做擬南芥的cDNA文庫（或部分基因文庫）．這些DNA分子中不含有非編碼區(qū)、內(nèi)含子，擴增獲得的目的基因與擬南芥細胞中該基因堿基序列不同．
（3）將人工合成的NPR1基因導入普通植物之前，需要構建含有NPR1基因的基因表達載體．根據(jù)圖1、2顯示：SmaI切割位點在綠色熒光蛋白基因上并會破壞NPR1基因，不能使用SmaI．又因為在NPR1基因左端只有PstI一種酶的切割位點，在右側有HindIII、EcoRI2個切割位點，因此對NPR1基因片段和質粒（圖2所示）進行酶切時，可選用限制酶的組合為HindⅢ和PstI或EcoRⅠ和Pst．
故答案為：
（1）轉錄和翻譯      逆轉錄     離體條件、需要高溫或高溫酶
（2）B和C           2⁵⁰cDNA文庫（或部分基因文庫）     不同
（3）含有NPR1基因的基因表達載體      HindⅢ和PstⅠEcoRⅠ和PstⅠ

點評 本題考查DNA分子的結構和基因工程的相關知識，解題前提是熟記基因工程的原理、操作工具和操作步驟，之后根據(jù)圖中的信息，推斷出構建基因表達載體所需的限制酶．本題要求考生具有一定的識記能力和分析能力，難度適中．