Question

【題目】目前基因工程所用的質粒載體主要是以天然細菌質粒的各種元件為基礎重新組建的人工質粒，pBR322質粒是較早構建的質粒載體，其主要結構如圖一所示：

（1）構建人工質粒時要有抗性基因，以便于___________________。

（2）對目的基因進行擴增的常用方法是PCR，該技術所依據的原理是__________________，PCR擴增某目的基因時需要引物___________種，擴增時，每個循環(huán)一般需要經過“變性、退火、延伸”三個過程，其中______過程的溫度設定是擴增成敗的關鍵。PCR中用到的酶為 _____________ 酶。

（3）若用噬菌體替代質粒作為運載體構建基因表達載體的過程中，是否需要利用CaCl2處理大腸桿菌，制備感受態(tài)細胞_______（需要 不需要） ，原因是_______________ 。

（4）用BamHI處理目的基因和質粒后用DNA連接酶連接獲得重組質粒，為了檢測該重組質粒是否導入原本無ampR和tetR的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布放到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布放到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結果(空圈表示與圖二對照無菌落的位置)。與圖三空圈相對應的圖二中的菌落表現(xiàn)型是 _____________________________圖三結果顯示，少數(shù)大腸桿菌導入的是 ______________ 。

Answer 1

【答案】鑒別目的基因是否導入受體細胞 DNA雙鏈復制 2 退火 Taq酶 不需要 噬菌體能通過侵染過程將自身的DNA注入到大腸桿菌中 能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素 重組質粒（基因表達載體）

【解析】

基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）質粒上的抗性基因常作為標記基因，其作用是鑒別目的基因是否導入受體細胞。
（2）PCR技術的原理是DNA雙鏈復制。PCR擴增某目的基因時需要2種引物，擴增時，每個循環(huán)一般需要經過“變性、退火、延伸”三個過程，其中退火過程的溫度設定是擴增成敗的關鍵。PCR中用到的酶為Taq 酶，該酶耐高溫。
（3）由于噬菌體能通過侵染過程將自身的DNA注入到大腸桿菌中，因此用噬菌體替代質粒作為運載體構建基因表達載體的過程中，不需要利用CaCl2處理大腸桿菌，制備感受態(tài)細胞。
（4）用BamHⅠ處理目的基因和質粒后用DNA連接酶連接獲得重組質粒，由于BamHⅠ處理質粒后破壞了四環(huán)素抗性基因，但沒有破壞氨芐青霉素抗性基因，因此成功導入重組質粒的大腸桿菌能能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素，即圖三空圈對應的圖二中的菌落能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素。圖三中空圈較少，這說明少數(shù)大腸桿菌導入的是重組質粒（基因表達載體）。