Question

【題目】圖甲為構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中的三種備選質(zhì)粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因。圖乙為培育轉(zhuǎn)AFPs基因(抗凍基因)番茄的示意圖，外源DNA和質(zhì)粒上均標(biāo)出了酶切位點(diǎn)及相關(guān)抗性基因，請回答下列問題。

(1)圖甲中通常選用質(zhì)粒C構(gòu)建重組質(zhì)粒，而不選用質(zhì)粒A或質(zhì)粒B的原因分別是______________________。

(2)據(jù)圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應(yīng)優(yōu)先選用限制酶________切割目的基因和質(zhì)粒。

(3)從cDNA文庫中獲得的目的基因________(填“含有”或“不含有”)啟動子和終止子。

(4)在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中常把兩個(gè)啟動子串聯(lián)在一起形成雙啟動子，加在目的基因上游。雙啟動子的作用可能是________。

(5)為使改造后的AFPs基因能夠表達(dá)，人工設(shè)計(jì)質(zhì)粒D并對它的多個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行研究。若用Hind Ⅲ酶或Kpn Ⅰ酶單獨(dú)切割質(zhì)粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)500bp和1個(gè)2666片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)250bp和1個(gè)3166 bp片段。若以HindⅢ酶切割位點(diǎn)為計(jì)算起點(diǎn)，則KpnⅠ酶切割位點(diǎn)與Hind Ⅲ酶切割位點(diǎn)最短長度為________bp。

Answer 1

【答案】質(zhì)粒A中沒有標(biāo)記基因，質(zhì)粒B的復(fù)制原點(diǎn)中含有HindⅢ酶切位點(diǎn) BamHⅠ和HindⅢ 不含有 保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄(高效表達(dá)) 750

【解析】

據(jù)圖分析，圖甲中質(zhì)粒A中沒有標(biāo)記基因；質(zhì)粒B中限制酶Hind Ⅲ的切割部位在復(fù)制圓點(diǎn)內(nèi)部，會破壞質(zhì)粒的功能；質(zhì)粒C有兩個(gè)標(biāo)記基因（Tc、Ap），其中Tc上有限制酶BamHⅠ的切割位點(diǎn)。圖乙為利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入番茄細(xì)胞，通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因番茄的過程，該過程選用的載體是質(zhì)粒C，根據(jù)目的基因兩側(cè)的限制酶種類和質(zhì)粒上的限制酶種類分析可知，使用的限制酶可以是BamHⅠ、HindⅢ或者EcoR Ⅰ、HindⅢ。

（1）圖甲中質(zhì)粒A缺乏標(biāo)記基因，質(zhì)粒B的復(fù)制原點(diǎn)中含有限制酶切割位點(diǎn)，可能會破壞復(fù)制原點(diǎn)，而質(zhì)粒C含有多個(gè)標(biāo)記基因和酶切位點(diǎn)，適宜作為基因工程的載體。

（2）圖乙中，選用的質(zhì)粒C作為基因工程的載體，結(jié)合目的基因兩端的酶切位點(diǎn)，目的基因和載體可以選擇BamHⅠ和HindⅢ同時(shí)切割，或者EcoRⅠ和HindⅢ同時(shí)切割，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應(yīng)優(yōu)先選用限制酶BamHⅠ(會破壞Tc )和HindⅢ切割，可以根據(jù)是否對四環(huán)素有抗性來篩選。

（3）cDNA文庫是用mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的DNA，只含有編輯對應(yīng)蛋白質(zhì)的信息，沒有控制該基因表達(dá)的相關(guān)元件（啟動子、終止子等），也沒有內(nèi)含子，因此cDNA文庫的基因不含有啟動子和終止子。

（4）啟動子是RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)，是起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)，雙啟動子可能是為了保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄。

（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨(dú)切割質(zhì)粒D，均獲得一條長鏈，說明該質(zhì)粒上只含有HindⅢ酶的一個(gè)酶切位點(diǎn)和KpnⅠ酶的一個(gè)酶切位點(diǎn)；若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割。則獲得2個(gè)500bp和1個(gè)2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)250bp和1個(gè)3166bp片段，說明EcoRⅠ酶有2個(gè)酶切位點(diǎn)，兩個(gè)位點(diǎn)之間的最短距離是500bp，而KpnⅠ酶的切點(diǎn)在2個(gè)EcoRⅠ酶切點(diǎn)之間，距離每個(gè)EcoRⅠ酶切點(diǎn)250bp，HindⅢ酶切點(diǎn)距離最近的EcoRⅠ酶切點(diǎn)的最短距離是500bp，距離另一個(gè)EcoRⅠ酶切點(diǎn)的距離是500+500=1000bp。因此，KpnⅠ酶切割位點(diǎn)與HindⅢ酶切割位點(diǎn)最短長度為250+500=750bp。