Question

【題目】圖甲為構建重組質粒過程中的三種備選質粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因。圖乙為培育轉AFPs基因(抗凍基因)番茄的示意圖，外源DNA和質粒上均標出了酶切位點及相關抗性基因，請回答下列問題。

(1)圖甲中通常選用質粒C構建重組質粒，而不選用質粒A或質粒B的原因分別是______________________。

(2)據圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質粒，應優(yōu)先選用限制酶________切割目的基因和質粒。

(3)從cDNA文庫中獲得的目的基因________(填“含有”或“不含有”)啟動子和終止子。

(4)在構建基因表達載體過程中常把兩個啟動子串聯(lián)在一起形成雙啟動子，加在目的基因上游。雙啟動子的作用可能是________。

(5)為使改造后的AFPs基因能夠表達，人工設計質粒D并對它的多個酶切位點進行研究。若用Hind Ⅲ酶或Kpn Ⅰ酶單獨切割質粒D，均獲得一條長鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個500bp和1個2666片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166 bp片段。若以HindⅢ酶切割位點為計算起點，則KpnⅠ酶切割位點與Hind Ⅲ酶切割位點最短長度為________bp。

Answer 1

【答案】質粒A中沒有標記基因，質粒B的復制原點中含有HindⅢ酶切位點 BamHⅠ和HindⅢ 不含有 保證目的基因的高效轉錄(高效表達) 750

【解析】

據圖分析，圖甲中質粒A中沒有標記基因；質粒B中限制酶Hind Ⅲ的切割部位在復制圓點內部，會破壞質粒的功能；質粒C有兩個標記基因（Tc、Ap），其中Tc上有限制酶BamHⅠ的切割位點。圖乙為利用農桿菌轉化法將重組質粒導入番茄細胞，通過組織培養(yǎng)技術獲得轉基因番茄的過程，該過程選用的載體是質粒C，根據目的基因兩側的限制酶種類和質粒上的限制酶種類分析可知，使用的限制酶可以是BamHⅠ、HindⅢ或者EcoR Ⅰ、HindⅢ。

（1）圖甲中質粒A缺乏標記基因，質粒B的復制原點中含有限制酶切割位點，可能會破壞復制原點，而質粒C含有多個標記基因和酶切位點，適宜作為基因工程的載體。

（2）圖乙中，選用的質粒C作為基因工程的載體，結合目的基因兩端的酶切位點，目的基因和載體可以選擇BamHⅠ和HindⅢ同時切割，或者EcoRⅠ和HindⅢ同時切割，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質粒，應優(yōu)先選用限制酶BamHⅠ(會破壞Tc )和HindⅢ切割，可以根據是否對四環(huán)素有抗性來篩選。

（3）cDNA文庫是用mRNA逆轉錄得到的DNA，只含有編輯對應蛋白質的信息，沒有控制該基因表達的相關元件（啟動子、終止子等），也沒有內含子，因此cDNA文庫的基因不含有啟動子和終止子。

（4）啟動子是RNA聚合酶結合的位點，是起始轉錄的位點，雙啟動子可能是為了保證目的基因的高效轉錄。

（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D，均獲得一條長鏈，說明該質粒上只含有HindⅢ酶的一個酶切位點和KpnⅠ酶的一個酶切位點；若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割。則獲得2個500bp和1個2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割，則獲得2個250bp和1個3166bp片段，說明EcoRⅠ酶有2個酶切位點，兩個位點之間的最短距離是500bp，而KpnⅠ酶的切點在2個EcoRⅠ酶切點之間，距離每個EcoRⅠ酶切點250bp，HindⅢ酶切點距離最近的EcoRⅠ酶切點的最短距離是500bp，距離另一個EcoRⅠ酶切點的距離是500+500=1000bp。因此，KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為250+500=750bp。