Question

1．下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導入巴斯德畢赤酵母菌生產乙肝疫苗的過程及有關資料，請分析回答下列問題：

資料1：巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，此時AOX1基因受到誘導而表達【5′AOX1和3′AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子】．
資料2：巴斯德畢赤酵母菌體內無天然質粒，所以科學家改造出了圖1所示的pPIC9K質粒用作載體，其與目的基因形成的重組質粒經酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現表達．
資料3：限制酶切位點

限制酶	識別序列及酶切位點
SnaBⅠ
AcrⅡ
SacⅠ
BalⅡ

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，應該在HBsAg基因兩側的A和B位置接
上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶識別序列，這樣設計的優(yōu)點是避免質粒和目的基因自身環(huán)化．
（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用DNA連接酶將其連接到pPIC9K質粒上，形成重組質粒，并將其導入大腸桿菌以獲取大量重組質粒．
（3）步驟3中應選用限制酶BglⅡ來切割重組質粒獲得重組DNA，然后將其導入巴斯德畢赤酵母菌細胞．
（4）為了確認巴斯德畢赤酵母菌轉化是否成功，在培養(yǎng)基中應該加入卡拉霉素以便篩選，轉化后的細胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子雜交方法進行檢測．
（5）轉化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時誘導HBsAg基因表達．
（6）與大腸桿菌等細菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細胞作為基因工程的受體細胞，其優(yōu)點是在蛋白質合成后，細胞可以對其進行加工（修飾）并分泌到細胞外，便于提�。�

Answer 1

分析 分析題圖：圖中質粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點，其中SacI位于啟動子上，BglⅡ位于終止子上．要將HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質粒，要獲取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，應選用限制酶BglⅡ來切割．5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，在培養(yǎng)基中加入卡那霉素以便篩選導入重組質粒的目的菌．

解答 解：（1）重組質粒上的目的基因若要表達，需要目的基因的首尾含有啟動子和終止子．而SnaBⅠ、AvrⅡ識別的序列在啟動子與終止子之間，只要在目的基因兩側A和B位置分別接上這兩種序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ這兩種內切酶對質粒和目的基因同時切割，便會各自出現相同的粘性末端，便于重組與表達，同時防止自身環(huán)化，因此在HBsAg基因兩側的A和B位置接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列．
（2）①用DNA連接酶將切割后的HBsAg基因和pPIC9K質粒連接成重組質粒；②導入大腸桿菌體內，目的是利用大腸桿菌無性繁殖速度，短時間內可獲取大量的重組質粒．
（3）重組DNA的兩側分別是啟動子和終止子，除BglⅡ外，其它限制酶會破壞含有啟動子、終止子的目的基因．
（4）用DNA分子雜交技術檢測是否導入目的基因．
（5）資料1顯示，甲醇為該酵母菌的唯一碳源，同時誘導HBsAg基因表達．
（6）酵母菌為真核生物，細胞內具有對分泌蛋白加工的內質網和高爾基體等細胞器，細菌等原核生物，不具有內質網和高爾基體等細胞器．
故答案為：
（1）SnaBⅠAvrⅡ
（2）DNA連接酶　大量重組質�！�
（3）BglⅡ
（4）DNA分子雜交
（5）甲醇　
（6）加工（修飾）

點評 本題結合工程菌形成過程，考查基因工程的相關知識，意在考查考生分析題圖獲取有效信息的能力；理解所學知識要點，把握知識間聯系的能力；能運用所學知識解決生物學問題的能力和應用能力．