Question

19．圖1為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，amp^R為青霉素抗性基因，tct^R為四環(huán)素抗性基因，P為啟動因子，T為終止子，ori為復制原點．已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內的多種酶的酶切位點．
（1）將含有目的基因的DNA與質粒表達載體分別用EcoRI酶切，酶切產物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產物有目的基因-載體連接物、載體-載體連接物、目的基因-目的基因連接物三種．若要從這些連接產物中分離出重組質粒，需要對這些連接產物進行分離純化．
（2）用上述3種連接產物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉化實驗．之后將這些宿主細胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是載體-載體連接物；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是目的基因-載體連接物．
（3）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是啟動子，其合成的產物是RNA．
（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒表達載體在酶切后產生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應選用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ．
（5）請在圖2中畫出某DNA片段被切割形成黏性末端的過程示意圖．
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Answer 1

分析 用上述兩種限制酶同時切割目的基因后，目的基因的兩個黏性末端不同，這樣目的基因就不會自連成環(huán)狀．同樣用上述兩種限制酶同時切割質粒后，質粒的兩個黏性末端也不同，這樣質粒也不會自連．這樣當把切割后目的基因和切割后質粒混合后，只有目的基因和質粒才能相連．產物中只有重組質粒，而無其他的連接產物．

解答 解：（1）由于含有目的基因的DNA片段和質粒上均含有EcoRI酶的切割位點，所以用此酶切割后產生相同的黏性末端．這樣，具有相同黏性末端的片段用DNA連接酶均可連接，從而產生3種連接產物，目的基因-載體連接物、載體-載體連接物、目的基因-目的基因連接物，所以要進行分離純化．
（2）由于將細胞放入含四環(huán)素的培養(yǎng)基，要將存活tct^R 為四環(huán)素抗性基因結構要保持完整，用EcoRI酶切后再用連接酶連接的三種產物只有載體-載體連接物基因結構保持完整；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是目的基因-載體連接物．
（3）目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是啟動子，其合成的產物是RNA．
（4）防止目的基因和基因和質粒表達載體在酶切后產生的末端發(fā)生任意連接，需要有兩種限制酶，而amp^R為青霉素抗性基因，P啟動子，T為終止子，ori為復制原點，結構不能被破壞，故選擇EcoRⅠ和BamHⅠ這兩種限制酶．
（5）DNA片段被切割形成黏性末端的過程示意圖為：
故答案為：
（1）目的基因-載體連接物      載體-載體連接物      目的基因-目的基因連接物      分離純化  
（2）載體-載體連接物  目的基因-載體連接物
（3）啟動子              RNA
（4）EcoRⅠ和BamHⅠ
（5）

點評 本題考查基因工程的相關知識，意在考查考生能運用所學知識與觀點，通過比較、分析與綜合等方法對某些生物學問題進行解釋、推理，做出合理的判斷或的能力．學生基因工程工具原理的應用理解不到位，特別是2種工具酶與獲取目的基因和表達載體之間的聯系與拓展．