Question

如圖表示含有目的基因D的DNA片段長度（bp即堿基對）和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構和部分堿基序列．現(xiàn)有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4種限制性核酸內(nèi)切酶切割的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．請回答下列問題：

（1）用圖1中的外源DNA（含有目的基因D）和圖2中的質(zhì)粒構建重組質(zhì)粒需要使用限制酶和

 

．前者（酶）的專一性很強，其作用特點是

 

．
（2）應該使用限制酶BamHⅠ同時處理質(zhì)粒、外源DNA，而不選擇其他3種，原因在于

 

．（多選） A．若使用SmaⅠ或者MspⅠ會破壞目的基因．
B．若使用SmaⅠ切割質(zhì)粒，能成功切開質(zhì)粒得到粘性末端的可能很低．
C．若使用MboⅠ切割質(zhì)粒，質(zhì)粒上會有2處被切開，會將質(zhì)粒切成兩段不利于篩選．
D．使用限制酶BamHⅠ能保證目的基因和質(zhì)粒獲得相同的粘性末端，以便目的基因和運載體定向連接，不至于反向連接．
E．使用BamHⅠ切割質(zhì)粒，質(zhì)粒上會有1處被切開，破壞抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于將來篩選含目的基因的受體細胞．
F．只有使用BamHⅠ切割，才能保證質(zhì)粒和目的基因上產(chǎn)生相同的粘性末端．
（3）若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對被T-A堿基對替換，那么基因D就突變?yōu)榛�因d．從雜合子分離出圖1及其對應的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，產(chǎn)物中共有

 

種不同DNA片段．若同時用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割圖2中的質(zhì)粒，則可得到

 

個DNA片段．
（4）為了篩選出成功導入含目的基因D的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般可進行如下步驟篩選：
第一步：將大腸桿菌在含

 

的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖3的菌落．
第二步：再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含

 

的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖4的結(jié)果（空圈表示與圖3對照無菌落的位置）．
第三步：選出圖3培養(yǎng)皿中的某些菌落進行培養(yǎng)，即可得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌．請在圖3中圈出含目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的菌落
以上篩選方式至少需要兩步，其實還有其他更簡單的操作方法．請閱讀下列材料，回答問題．
大腸桿菌pUC118質(zhì)粒的某限制酶唯一酶切序列，位于該質(zhì)粒的lacZ基因中．lacZ基因中如果沒有插入外源基因，便可表達出β-半乳糖苷酶．當培養(yǎng)基中含有A物質(zhì)時，A物質(zhì)便會被β-半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落；如果lacZ基因中插入了外源基因，帶有pUC118質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達β-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的A物質(zhì)不會被水解成藍色，大腸桿菌將形成白色菌落．pUC118質(zhì)粒還攜帶了氨芐青霉素抗性基因．如圖5是利用lacZ基因篩選重組質(zhì)粒示意圖．
（5）用圖5中的培養(yǎng)基中篩選導入了重組質(zhì)粒的受體大腸桿菌，制備時除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外還應加入物質(zhì)應包括

 

（多選） A．伊紅美藍試劑  B．瓊脂  C．A物質(zhì)  D．氨芐青霉素  E．四環(huán)素  F．噬菌體
（6）將上述處理后的大腸桿菌置于圖5中培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以檢測受體大腸桿菌是否導入重組質(zhì)粒，結(jié)果可能出現(xiàn)藍色或者白色菌落，其中

 

色大腸桿菌菌落即為含重組質(zhì)粒的目的菌．

Answer 1

考點：基因工程的原理及技術,微生物的分離和培養(yǎng)

專題：

分析：分析圖1：圖中DNA片段含有2個限制酶SmaⅠ切割位點，可被限制酶SmaⅠ切割產(chǎn)生長度為534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp的三中DNA片段．基因D兩側(cè)序列為GGATCC，可被限制酶BamHⅠ切割．
分析圖2：質(zhì)粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列，其中CCGG序列可被限制酶MspⅠ切割，GGATCC序列和GATC序列可被限制酶MboⅠ切割．用限制酶BamHⅠ切割破壞了抗生素A抗性基因，但沒有破環(huán)抗生素B抗性基因，因此含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗抗生素B，但不能抗抗生素A．

解答： 解：（1）用圖1中的外源DNA（含有目的基因D）和圖2中的質(zhì)粒構建重組質(zhì)粒需要使用限制酶和DNA連接酶．限制酶的專一性很強，其作用特點是能夠識別特點的堿基序列并加以切割．
（2）A、若使用SmaⅠ或者MspⅠ會破壞目的基因，A正確；
B、之所以不用SmaⅠ限制酶，原因是這種酶切割目的基因會破壞目的基因，利用這種酶質(zhì)粒，不可能得到粘性末端，B錯誤；
C、若使用MboⅠ切割質(zhì)粒，質(zhì)粒上會有2處被切開，并且兩個抗性基因均會被破壞，這將不利于篩選，C正確；
D、使用限制酶BamHⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，使目的基因和質(zhì)粒獲得相同的粘性末端，這會導致目的基因和運載體反向連接，D錯誤；
E、使用BamHⅠ切割質(zhì)粒，質(zhì)粒上會有1處被切開，破壞抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于將來篩選含目的基因的受體細胞，E正確；
F、利用BamHⅠ或MboⅠ切割，能保證質(zhì)粒和目的基因上產(chǎn)生相同的粘性末端，F(xiàn)錯誤．
（3）雜合子的基因型為Dd，其中D基因片段有兩個SmaⅠ酶切位點，完全切割后出現(xiàn)三個片段長度分別是537bp、790bp、661bp，發(fā)生基因突變后的d基因片段只有一個SmaⅠ酶切位點，完全切割后出現(xiàn)兩個片段長度分別是1327bp、661bp，所以從雜合子中分離的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后形成會四種不同的DNA片段．限制酶MspⅠ在質(zhì)粒上存在一個酶切位點，而限制酶MboⅠ在質(zhì)粒上存在于兩個酶切位點，因此同時用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割圖2中的質(zhì)粒，則可得到3個DNA片段．
（4）分析圖解可知，該基因工程中，最好選擇限制酶BamHⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，但是利用該酶切割將會破壞抗生素A抗性基因，則抗生素B抗性基因為重組質(zhì)粒中的標記基因．在篩選過程中，首先讓大腸桿菌在含抗生素B的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到圖3的菌落是含有目的基因及抗生素B抗性基因的菌落；再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含抗生素A的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到圖4的結(jié)果，則圖4中的菌落是既含抗生素B抗性基因又含有抗生素A抗性基因的菌落．所以選出圖3中有但圖4中對應部位沒有的菌落進行培養(yǎng)，就可以得到含重組質(zhì)粒的大腸桿菌．
（5）根據(jù)題意可知，pUC118質(zhì)粒還攜帶了氨芐青霉素抗性基因，因此制備培養(yǎng)基時需要加入氨芐青霉素進行篩選，同時還需要加入瓊脂作為培養(yǎng)基的凝固劑，A物質(zhì)用于鑒定lacZ基因是否被破壞．
（6）如果lacZ基因中插入了外源基因，帶有pUC118質(zhì)粒的大腸桿菌便不能表達β-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基中的A物質(zhì)不會被水解成藍色，大腸桿菌將形成白色菌落．因此其中白色大腸桿菌菌落即為含重組質(zhì)粒的目的菌．
故答案為：
（1）DNA連接酶     能夠識別特點的堿基序列并加以切割
（2）ACE
（3）4    3  
（4）抗生素B      抗生素A   
畫圖如右 
（5）B、C、D 
（6）白

點評：本題結(jié)合圖解，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理、操作工具及操作步驟，能結(jié)合圖中限制酶的識別序列判斷所選限制酶的種類，再根據(jù)抗性基因進行篩選，同時能結(jié)合圖中和題中的數(shù)據(jù)答題．