Question

【題目】苯丙酮尿癥是PKU基因突變引起，研究人員嘗試用基因治療的方式治療該疾病，即將正�；�因D導入攜帶有突變基因的細胞中。下圖中的圖甲為A、B、C三種質(zhì)粒，圖乙為含有目的基因 D的DNA片段，圖丙表示重組載體的示意圖。其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因，lacZ 為藍色顯色基因（基因表達的產(chǎn)物將無色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成一種藍色物質(zhì)，菌落呈藍色），EcoRⅠ（0.7Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）等為限制酶及其切割位點與復(fù)制原點之間的距離。已知 1 Kb＝1 000 個堿基對。請結(jié)合所學知識回答：

（1）將正常的D基因?qū)�入受體細胞的基因工程操作步驟中，其核心是________，據(jù)圖分析上述甲圖中三種質(zhì)粒中不宜作為運載體的有________，請分析原因________。

（2）若要獲取目的基因D，上述乙圖中應(yīng)選擇限制酶________對其所在的DNA進行切割。如果僅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，通常可根據(jù)該基因首尾兩端的已知核苷酸序列合成________，利用________技術(shù)得到大量目的基因。

（3）將目的基因 D 和甲圖中可做載體的質(zhì)粒進行連接后，會得到圖丙中三種連接方式。需要選出正向連接的重組質(zhì)粒，可使用________酶切割所獲得的重組質(zhì)粒。完全酶切后，進行電泳分析。若是載體自連，電泳圖譜中出現(xiàn) 2.7Kb 一條帶，若是正向連接載體和反向連接載體，電泳圖譜中出現(xiàn)長度分別為________和________。

（4）選擇自身不含lacZ基因且對抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細胞，在已轉(zhuǎn)化的含重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒的受體細胞中和未轉(zhuǎn)化成功的細胞中如何篩選出成功導入重組質(zhì)粒的受體細胞_______________。

Answer 1

【答案】基因表達載體的構(gòu)建 AC 質(zhì)粒A缺少標記基因，質(zhì)粒C復(fù)制原點被限制酶切割 PvuⅠ 引物 PCR EcoRⅠ 1.1Kb和5.6Kb 3.1Kb和3.6Kb 在含有氨芐青霉素的加入X-gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化后的細胞，形成白色菌落的即為導入重組質(zhì)粒的受體細胞，藍色菌落的沒有導入重組細胞

【解析】

分析圖甲：質(zhì)粒A含有EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶割位點，無標記基因；質(zhì)粒B含有中Ap基因和lacZ基因，且EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶切位點位于lacZ基因內(nèi)；質(zhì)粒C含有中Ap基因和Tc基因，含有EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶割位點，PvuⅠ限制酶割位點位于復(fù)制原點。

（1）基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟，其中基因工程的核心是基因表達載體的構(gòu)建。圖中質(zhì)粒A缺少標記基因；質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時，復(fù)制原點會被限制酶切割，會影響重組質(zhì)粒的自主復(fù)制。因此，不能作為目的基因運載體的質(zhì)粒是A、C。

（2）分析乙圖，目的基因D上有兩個PvuⅠ酶切位點和一個EcoRⅠ酶切位點，而EcoRⅠ酶切會破壞目的基因D的結(jié)構(gòu)，因此應(yīng)選用PvuⅠ酶對其所在的DNA進行切割。利用PCR擴增技術(shù)可以獲得大量的目的基因，用PCR擴增基因之前，需要先根據(jù)該基因已知核苷酸序列制出相應(yīng)的引物。

（3）在目的基因上存在EcoRⅠ酶的切割位點，因此在基因工程的操作過程中，需要選出正向連接的重組質(zhì)粒，應(yīng)使用該酶切重組質(zhì)粒。依題意和圖甲、乙可知，由于目的基因D的長度為4.0Kb，因此用質(zhì)粒B構(gòu)建的重組質(zhì)粒的長度為4.0Kb+2.7Kb=6.7Kb，重組質(zhì)粒被EcoRⅠ酶完全切割后，出現(xiàn)兩個不同長度片段，若是正向連接（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位點與質(zhì)粒B上的EcoRⅠ酶切位點的距離最近），會得到0.1Kb+1.0Kb=1.1Kb和（2.7Kb+4.0Kb）-1.1Kb=5.6Kb的兩個片段；若是反向連接（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位點與質(zhì)粒B上的EcoRⅠ酶切位點的距離較遠），會得到0.1Kb+3.0Kb=3.1Kb和（2.7Kb+4.0Kb）-3.1Kb=3.6Kb的兩個片段。

（4）在含有氨芐青霉素的加入X-gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化后的細胞，導入重組質(zhì)粒的受體細胞，質(zhì)粒上lacZ基因被破環(huán)，不能將無色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成藍色物質(zhì)，且質(zhì)粒中含有Ap基因，故受體菌能在培養(yǎng)基上正常生長，形成白色菌落；導入空質(zhì)粒的受體細胞，具有Ap基因和lacZ基因，故能在培養(yǎng)基上生長，且能將無色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成藍色物質(zhì)，菌落呈藍色；未轉(zhuǎn)化成功的細胞中不含Ap基因，故不能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長。