Question

【題目】科學(xué)家將人的生長(zhǎng)激素基因與大腸桿菌的DNA分子進(jìn)行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達(dá)。但在進(jìn)行基因工程的操作過(guò)程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是一↓GATC—，請(qǐng)據(jù)圖回答：

（1）在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程中，應(yīng)用限制酶_______切割質(zhì)粒，用限制酶________切割目的基因。用限制酶切割目的基因和載體后形成的黏性末端通過(guò)_________原則進(jìn)行連接。

（2）在過(guò)程③中一般將受體大腸桿菌用__________進(jìn)行處理，以增大___________的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒容易進(jìn)入受體細(xì)胞。

（3）將得到的大腸桿菌B涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，得到如圖a所示的結(jié)果（圓點(diǎn)表示菌落），該結(jié)果說(shuō)明能夠生長(zhǎng)的大腸桿菌中已導(dǎo)入了__________，反之則沒(méi)有導(dǎo)入；再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基a上，使絨布表面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖b所示的結(jié)果(圓圈表示與圖a中培養(yǎng)基上對(duì)照無(wú)菌落的位置）。與圖b圓圈相對(duì)應(yīng)的圖a中的菌落表現(xiàn)型是__________，這些大腸桿菌中導(dǎo)入了______________________。

Answer 1

【答案】Ⅰ Ⅱ 堿基互補(bǔ)配對(duì) CaCl2溶液 細(xì)胞壁 普通質(zhì)粒或重組質(zhì)粒 抗氨芐青霉素而不抗四環(huán)素 重組質(zhì)粒

【解析】

已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是一↓GATC—，如果用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒，兩個(gè)標(biāo)記基因都被破壞，所以上述質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割；分析題圖可知，要獲取目的基因用限制酶Ⅱ切割。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，還要加入適量的DNA連接酶。質(zhì)粒上至少要有一個(gè)標(biāo)記基因的理由是檢測(cè)重組質(zhì)粒(或目的基因)是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。

（1）由題意可知，限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是一↓GATC—，因此，限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ能切割的位置限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ也可以切割，限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ和限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ在質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)均位于標(biāo)記基因上，為了保證質(zhì)粒上至少保留一個(gè)標(biāo)記基因，所以切割質(zhì)粒時(shí)需用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ。目的基因兩端的限制酶識(shí)別序列不同，由于限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ能切割的位置限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ也可以切割，所以切割目的基因可用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ。用限制酶切割目的基因和運(yùn)載體后形成的黏性末端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行連接。

（2）在過(guò)程③一般將受體大腸桿菌用CaCl2（Ca2+或鈣離子）處理，以增大細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒容易進(jìn)入受體細(xì)胞。

（3）由于基因表達(dá)載體上的標(biāo)記基因是抗氨芐青霉素基因，將得到的大腸桿菌B涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌中都含有抗氨芐青霉素基因，所以，大腸桿菌細(xì)胞中導(dǎo)入的可能是普通質(zhì)粒，也可能是重組質(zhì)粒；再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基a上，使絨布表面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分析得到的結(jié)果可知，圖中b空圈無(wú)菌落形成，說(shuō)明與之相對(duì)應(yīng)的圖a中的菌落應(yīng)該是對(duì)四環(huán)素沒(méi)有抗性，其表現(xiàn)型是抗氨芐青霉素但不抗四環(huán)素，可以確定這些菌體中導(dǎo)入的一定是重組質(zhì)粒。