Question

11．探究如何從土壤中分離自生固氮菌并計(jì)數(shù)．
實(shí)驗(yàn)原理：農(nóng)田的表層土壤中，自生固氮菌的含量比較多．將用表層土制成的稀泥漿，接種到無氮培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)．在這種情況下，只有自生固氮菌才能生長繁殖．
材料用具：農(nóng)田的表層土壤、無氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、盛9mL無菌水的大試管若干、無菌移液管、無菌涂布器、無菌培養(yǎng)皿、盛90mL無菌水的錐形瓶、酒精燈、恒溫箱．
方法步驟：
（1）倒平板．分別將無氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板，應(yīng)在酒精燈火焰旁操作．
（2）制備土壤稀釋液．取土樣10g加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻．用無菌移液管吸取上清液 1mL，轉(zhuǎn)至9mL無菌水的大試管中，依次稀釋到10⁷倍稀釋度．為實(shí)現(xiàn)無菌操作，試管口和移液管應(yīng)在離火焰1～2cm處．
（3）涂布．按照由10⁷～10³稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布，每個(gè)稀釋度下，無氮培養(yǎng)基應(yīng)至少涂布3個(gè)平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布1個(gè)平板．
（4）培養(yǎng)．放入恒溫箱內(nèi)，在適宜溫度條件下培養(yǎng)3～4d．一般每隔24h統(tǒng)計(jì)一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目．
（5）細(xì)菌的計(jì)數(shù)．選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)．如果測試的平均值為50，則每克樣品中的菌株數(shù)是5×10⁷．（稀釋度是10⁵）
（6）預(yù)期結(jié)果．相同稀釋度下，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)多于（填“多于”或“少于”）無氮培養(yǎng)基上的數(shù)目．理由是無氮培養(yǎng)基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上幾乎允許土壤中所有菌類的生存．

Answer 1

分析 1．分離菌株的思路
（1）自然界中目的菌株的篩選
①依據(jù)：根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找．
②實(shí)例：PCR技術(shù)過程中用到的耐高溫的Taq DNA聚合酶，就是從熱泉中篩選出來的Taq細(xì)菌中提取出來的．
（2）實(shí)驗(yàn)室中目的菌株的篩選
①原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度．pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長．
培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理：培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源．缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物
②方法：能合成脲酶的細(xì)菌才能分解尿素．配制以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，能夠生長的細(xì)菌就是能分解尿素的細(xì)菌
2．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法
（1）稀釋涂布平板法（間接）
①當(dāng)樣品的稀釋庋足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌．
②通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)來推測樣品中大約含有的活菌數(shù)．
（2）利用顯微鏡直接計(jì)數(shù)
3．分解尿素的細(xì)菌的鑒定細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)．在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變紅，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素．
4．實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣→樣品的稀釋→將稀釋液涂布到以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上→挑選能生長的菌落→鑒定

解答 解：（1）倒平板應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行，防止雜菌污染．
（2）制備土壤稀釋液．取土樣10g加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻．用無菌移液管吸取上清液 1mL，轉(zhuǎn)至9mL無菌水的大試管中，依次稀釋到10⁷倍稀釋度．為實(shí)現(xiàn)無菌操作，試管口和移液管應(yīng)在離火焰1-2cm處．
（3）按照由10¹～10⁸倍稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布，每個(gè)稀釋度下，無氮培養(yǎng)基應(yīng)至少涂布3個(gè)平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布1個(gè)平板做對(duì)照．
（4）培養(yǎng)．放入恒溫箱內(nèi)，在適宜溫度條件下培養(yǎng)3～4d．一般每隔24h統(tǒng)計(jì)一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目．
（5）當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取茵落數(shù)在30-300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)．如果測試的平均值為50，則每克樣品中的菌落數(shù)是（稀釋度是10⁵倍）5×10⁷．
（6）牛肉膏蛋白胨平板上的菌落數(shù)多于無氮培養(yǎng)基上的數(shù)目，原因是無氮培養(yǎng)基上能生存繁殖的僅是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上幾乎允許土壤中所有菌類生存．
故答案為：
（1）酒精燈火焰旁
（2）1～2
（3）1
（4）因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目
（5）5×10⁷
（6）多于　 無氮培養(yǎng)基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上幾乎允許土壤中所有菌類的生存

點(diǎn)評(píng) 本題通過探究實(shí)驗(yàn)的過程考查微生物的培養(yǎng)、分離和計(jì)數(shù)等知識(shí)點(diǎn)，要求考生識(shí)記接種微生物常用的兩種方法及相關(guān)操作；掌握微生物的計(jì)數(shù)方法，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確答題．