Question

【題目】回答下列有關(guān)現(xiàn)代生物技術(shù)的問題。

哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的酶M在工業(yè)上極具應(yīng)用價值，現(xiàn)擬利用大腸桿菌大規(guī)模生產(chǎn)該酶。哺乳動物DNA片段如圖1所示，用作運載體的質(zhì)粒pXY6如圖2所示，VanR表示萬古霉素抗性基因，GFP基因則編碼綠色熒光蛋白，大腸桿菌不具有這兩種基因。相關(guān)限制酶的所有酶切位點均已于圖上標(biāo)注，識別序列見表。

NsiI	PstI	SbfI	BclI	BspEI
ATGCA↓T T↑ACGTA	CTGCA↓G G↑ACGTC	CCTGCA↓GG GG↑ACGTCC	T↓GATCA ACTAG↑T	T↓CCGGA AGGCC↑T

（重組質(zhì)粒的構(gòu)建及分析）

（1）現(xiàn)要在只使用一種限制酶的情況下，從哺乳動物DNA中切下酶M基因，并切開質(zhì)粒pXY6，連接二者獲得重組質(zhì)粒pXY7，則應(yīng)選擇的限制酶是___________。

（2）若用BspE1和SbfI聯(lián)合酶切質(zhì)粒pXY6，可得1.2kb和2.1kb兩種長度的片段。若用BspE1單獨酶切若干份質(zhì)粒pXY7，則有兩種不同的酶切結(jié)果：其中一種結(jié)果得1.7kb和3.1kb兩種長度的片段，則另一種結(jié)果得___________kb和___________kb兩種長度的片段。

（工程菌的篩選及產(chǎn)品加工）

（3）被成功導(dǎo)入pXY7質(zhì)粒的工程菌應(yīng)具備的特點是___________

A．具萬古霉素抗性，發(fā)綠色熒光 B．具萬古霉素抗性，不發(fā)綠色熒光

C．不具萬古霉素抗性，發(fā)綠色熒光 D．不具萬古霉素抗性，不發(fā)綠色熒光

（4）對工程菌生產(chǎn)出的酶M進(jìn)行分離純化的步驟是（用數(shù)字編號填空）：

破碎細(xì)胞→過濾獲濾液→___________→___________→___________→酶制劑

①通過層析提純酶蛋白 ②通過冷凍干燥結(jié)晶酶蛋白 ③改變pH或加入硫酸銨使酶蛋白沉淀

（5）上述工藝流程涉及的生物工程領(lǐng)域包括___________（多選）

A．發(fā)酵工程 B．基因工程 C．細(xì)胞工程 D．酶工程

Answer 1

【答案】PstI 2.7 2.1 B ③ ① ② BD

【解析】

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的獲取：（1）目的基因是指： 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。（2）獲取方法：①從基因文庫中獲取；②人工合成（反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法）；③PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。

2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建:（1）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（2）組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因。①啟動子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。③標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。

3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞:（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射技術(shù)、Ca2+處理法。（3）重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。

4、目的基因的檢測和表達(dá)：（1）首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。（2）其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原--抗體雜交。（4）有時還需進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。

（1）現(xiàn)要在只使用一種限制酶的情況下，從哺乳動物DNA中切下酶M基因，并切開質(zhì)粒pXY6，連接二者獲得重組質(zhì)粒pXY7，所選的限制酶應(yīng)該在目的基因和質(zhì)粒上都有識別及切割位點，結(jié)合圖1、圖2及表格信息判斷，可以選擇限制酶PstI。

（2）若用BspE1和SbfI聯(lián)合酶切質(zhì)粒pXY6，可得1.2kb和2.1kb兩種長度的片段。說明上邊BspE1和SbfI之間為1.2kb，下邊為2.1kb，若用BspE1單獨酶切若干份質(zhì)粒pXY7，另一種結(jié)果得1.2+1.5＝2.7kb和2.1kb。

（3）被成功導(dǎo)入pXY7質(zhì)粒的工程菌萬古霉素抗性基因，不含GFP基因，所以工程菌具萬古霉素抗性，不發(fā)綠色熒光的特點，故選B。

（4）通過加入硫酸銨的方式讓蛋白質(zhì)沉淀，通過層析的方式對蛋白進(jìn)行提純，通過冷凍干燥結(jié)晶酶蛋白，故順序是③①②。

（5）上述工藝流程涉及的生物工程領(lǐng)域包括基因工程和酶工程，故選BD。