Question

14．請分析回答下列有關(guān)基因工程問題
胰島素A、B鏈分別表達(dá)法是生產(chǎn)胰島素的方法之一． 圖1是該方法所用的基因表達(dá)載體，圖2表示利用大腸桿菌作為工  程菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程（融合蛋白  A、B分別表示β-半乳糖苷酶與胰島素A、B鏈融合的蛋白）．

（1）圖1基因表達(dá)載體中沒有標(biāo)注出來的基本結(jié)構(gòu)是終止子．
（2）圖1中啟動子是RNA聚合 酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達(dá)；氨芐青霉素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來．
（3）構(gòu)建基因表達(dá)載體時必需的工具酶有限制酶和DNA連接酶．
（4）β-半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達(dá)，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點(diǎn)隱藏在內(nèi)部，其意義在于防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解．
（5）溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，用溴化氰處理相應(yīng)的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β-半乳糖苷酶被切成多個肽段，這是因?yàn)棣?半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸，而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸．
（6）根據(jù)圖2中胰島素的結(jié)構(gòu)，請推測每個胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量．你的推測結(jié)果是至少2個，理由是兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基，氨基酸的R基中可能還含有游離的氨基．
（7）如果圖1所示的載體可被A、B、C三種限制性內(nèi)切酶同時切割．單獨(dú)A切割得一條長鏈，單獨(dú)B切也得一條長鏈，A和C同時切割得2個500bp和1個2666bp片段，B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段．若以A的切割位點(diǎn)為計(jì)算起點(diǎn)，則B的切割位點(diǎn)與A點(diǎn)最短長度為750bp，C的兩個切割位點(diǎn)與A點(diǎn)的最短距離分別為500bp、1000bp．
（8）如限制酶SmaI能識別如圖3的「5‘-CCCGGG-3’」6個堿基序列，并在中央（圖中箭頭位置）切斷DNA．則用限制酶SmaI處理如圖的線狀雙鏈DNA時，請以箭頭標(biāo)出切割位置．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）根據(jù)題意和圖示分析可知：圖1基因表達(dá)載體中已有目的基因、啟動子和標(biāo)記基因，所以沒有標(biāo)注出來的基本結(jié)構(gòu)是終止子．
（2）圖1中啟動子是RNA聚合酶酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能啟動目的基因的表達(dá)即轉(zhuǎn)錄過程；氨芐青霉素抗性基因的作用是作為標(biāo)記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來．
（3）構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中，必須用相同的限制酶切割（含目的基因的外源DNA分子）和運(yùn)載體，以產(chǎn)生相同的黏性末端，再加入DNA連接酶將目的基因和運(yùn)載體連接形成重組DNA分子．
（4）β-半乳糖苷酶與胰島素A鏈或B鏈融合表達(dá)，可將胰島素肽鏈上蛋白酶的切割位點(diǎn)隱藏在內(nèi)部，這樣可以防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解．
（5）溴化氰能切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵，由于β-半乳糖苷酶中含有多個甲硫氨酸，而胰島素的A、B鏈中不含甲硫氨酸，所以用溴化氰處理相應(yīng)的融合蛋白能獲得完整的A鏈或B鏈，且β-半乳糖苷酸被切成多個肽段．
（6）由于一個肽鏈中至少有一個游離的氨基和一個游離的羧基，在肽鏈內(nèi)部的R基中可能也有氨基和羧基，而胰島素含有A鏈和B鏈，所以每個胰島素分子中所含游離氨基的數(shù)量至少是2個．
（7）分析題意可知，限制酶A和B在質(zhì)粒上均只含有一個切割位點(diǎn)，限制酶C在質(zhì)粒上有2個切割位點(diǎn)．由于B和C同時切割得2個250bp和1個3166bp片段，說明限制酶B的切點(diǎn)在限制酶C的兩個短距離的切點(diǎn)之間，因此若以A的切割位點(diǎn)為計(jì)算起點(diǎn)，則B的切割位點(diǎn)與A點(diǎn)最短長度=500+250=750bp，則畫圖可知C的兩個切割位點(diǎn)與A點(diǎn)的最短距離分別為500bp、1000bp．
（8）分析圖解可知，限制酶SmaI能識別如圖3的「5‘-CCCGGG-3’」6個堿基序列，并在中央切斷DNA形成的平末端，因此它的切割位點(diǎn)為C和G之間．

故答案為：
（1）終止子   
（2）RNA聚合    作為標(biāo)記基因，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來
（3）限制酶和DNA連接酶
（4）防止胰島素的A、B鏈被菌體內(nèi)蛋白酶降解
（5）β-半乳糖苷酶中含多個甲硫氨酸，而胰島素A、B鏈中不含甲硫氨酸
（6）至少2個    兩條肽鏈的一端各有一個游離的氨基，氨基酸的R基中可能還含有游離的氨基
（7）750bp     500bp     1000bp 
（8）

點(diǎn)評 本題結(jié)合圖解，考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生識記基因工程的操作工具及具體的操作步驟，掌握各步驟中的相關(guān)細(xì)節(jié)，能結(jié)合圖中信息準(zhǔn)確答題，屬于考綱識記和理解層次的考查．