Question

6．Vash2基因在肝癌、卵巢癌、乳腺癌等組織中表達(dá)程度較高，有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用．為研究其具體作用機(jī)制，研究者應(yīng)用Cas9/sgRNA系統(tǒng)構(gòu)建了Vash2基因敲除的小鼠模型，該系統(tǒng)作用機(jī)理如圖1所示．

（1）Cas9系統(tǒng)最早在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，是細(xì)菌用來抵御噬菌體DNA等外源DNA片段入侵而建立的機(jī)制，相當(dāng)于人類的免疫系統(tǒng)．
（2）為敲除Vash2基因，需要設(shè)計sgRNA（單鏈向?qū)�RNA），由圖可知，sgRNA的一段序列能與Vash2基因進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對．研究者通過顯微注射技術(shù)將sgRNA和Cas9mRNA導(dǎo)入小鼠受精卵．在受精卵中，sgRNA可以引導(dǎo)由Cas9mRNA通過翻譯過程產(chǎn)生的Cas9酶在配對區(qū)域定點(diǎn)剪切，使Vash2基因片段Ⅱ（填圖中羅馬數(shù)字）發(fā)生缺失從而導(dǎo)致基因突變．
（3）被敲除基因的鼠經(jīng)胚胎移植，最后獲得44只F₀代小鼠，經(jīng)PCR檢測和基因測序，從中選出1號、3號、5號、39號為陽性高效敲除小鼠．由于是隨機(jī)敲除，導(dǎo)致不同個體丟失的基因片段大小不同，具體情況見表

編號	敲除的總片段長度（bp）	敲除的有效片段長度（bp）
1（♂）	169	169
3（♂）	196	196
5（♀）	429	268
39（♀）	483	200

盡管得到的四只小鼠都是純合子，但由于丟失片段不同，通常F₀代小鼠之間不能相互交配．為了得到能穩(wěn)定傳代的Vash2基因敲除純合子，研究者從上表中選擇5號小鼠和野生雄性鼠交配，得到F₁代Vash2雜合子．選擇5號小鼠的原因是：5號小鼠敲除的有效片段長度較大．
（4）F₁代小鼠相互交配得到F₂代，將F₂代小鼠進(jìn)行Vash2基因PCR電泳檢測，結(jié)果如圖2所示．A、B、C三種小鼠中代表Vash2基因敲除純合子的是A，這種類型的小鼠在F₂代中的比例理論上為25%．

Answer 1

分析 根據(jù)題意和圖示分析可知：敲除基因時，sgRNA與Vash2基因的部分序列互補(bǔ)配對，細(xì)胞內(nèi)的Cas9酶在配對區(qū)域定點(diǎn)剪切，引起Vash2基因發(fā)生堿基對缺失，導(dǎo)致基因突變．該過程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用類似于限制酶的作用，敲除后需要DNA連接酶對DNA上的切口進(jìn)行修復(fù)．

解答 解：（1）細(xì)菌內(nèi)的Cas9系統(tǒng)可抵御噬菌體DNA等外源DNA片段入侵，相當(dāng)于人類的免疫系統(tǒng)，對自身起保護(hù)作用．
（2）據(jù)圖可知，sgRNA的一段序列能與Vash2基因進(jìn)行雜合，說明兩者之間進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對．小鼠屬于動物，所以研究者可通過顯微注射技術(shù)將sgRNA和Cas9mRNA導(dǎo)入小鼠受精卵．在受精卵中，sgRNA可以引導(dǎo)由Cas9mRNA通過翻譯過程產(chǎn)生的Cas9酶在配對區(qū)域定點(diǎn)剪切，使Vash2基因片段Ⅱ發(fā)生缺失，堿基對減少，從而導(dǎo)致基因突變．
（3）根據(jù)題意和圖表分析可知：在1號、3號、5號、39號中，5號小鼠（♀）敲除的有效片段長度較大，為268bp，所以可選擇5號小鼠和野生雄性鼠交配，得到F₁代Vash2雜合子．
（4）將F₂代小鼠進(jìn)行Vash2基因PCR電泳檢測，A中沒有Vash2標(biāo)識序列，說明其代表Vash2基因敲除純合子．由于F₁代小鼠相當(dāng)于雜合子，所以這種類型的小鼠在F₂代中的比例理論上為25%．
故答案為：
（1）免疫
（2）進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對        顯微注射     翻譯Ⅱ
（3）野生雄性      5號小鼠敲除的有效片段長度較大
（4）A      25%

點(diǎn)評 本題以“基因敲除”為題材，考查了基因工程以及基因分離定律的有關(guān)知識，要求考生能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)表格數(shù)據(jù)得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，能夠根據(jù)敲除過程圖解明確敲除的本質(zhì)，并能夠利用測交實(shí)驗(yàn)對敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，具有一定的難度．