Question

目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如圖一所示．請(qǐng)回答以下基因工程技術(shù)操作中的問題：

（1）構(gòu)建人工質(zhì)粒時(shí)不光要有抗性基因、復(fù)制原點(diǎn)等，還應(yīng)該具備RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，以驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄，該部位稱為

 

．
（2）獲取目的基因后可以用PCR技術(shù)擴(kuò)增．PCR儀器可以模擬DNA雙鏈在體內(nèi)的復(fù)制，所不同的是，PCR過程中的DNA聚合酶（taq酶）的

 

性比體內(nèi)的DNA聚合酶強(qiáng)；而在PCR過程中通過加熱（90-95℃）達(dá)到的結(jié)果，和體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)所需

 

酶的作用相同．
（3）受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入目的基因的方法也不同．如受體細(xì)胞是植物細(xì)胞，可選用

 

轉(zhuǎn)化法；如受體細(xì)胞是細(xì)菌，則先用Ca²⁺處理，將其轉(zhuǎn)化為一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為

 

細(xì)胞．將人胰島素基因?qū)�入大腸桿菌內(nèi)且成功表達(dá)后，提取的產(chǎn)物還需進(jìn)行體外加工和改良，因?yàn)榇竽c桿菌缺乏

 

（細(xì)胞器），無法加工形成胰島素．
（4）pBR322分子中另有單個(gè)的BamHⅠ限制酶作用位點(diǎn)，現(xiàn)將經(jīng)限制酶BamHⅠ處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理后得到的目的基因，通過DNA連接酶作用恢復(fù)

 

鍵，成功地獲得了重組質(zhì)粒，這說明限制酶BamHⅠ和限制酶BglⅡ的酶切產(chǎn)物具有

 

．
（5）為了檢測(cè)上述重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無amp^R和tet^R的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落．再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結(jié)果（空圈表示與圖二對(duì)照無菌落的位置）．與圖三空圈相對(duì)應(yīng)的圖二中的菌落表現(xiàn)型是

 

，圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是

 

質(zhì)粒．

Answer 1

考點(diǎn)：基因工程的原理及技術(shù)

專題：

分析：分析題圖：菌落能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基生存，說明了菌落含有抗氨芐青霉素基因；將沾上菌落絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，仍能生長(zhǎng)，說明了菌落也含有抗四環(huán)素基因，不能生長(zhǎng)的則不含抗四環(huán)素基因．

解答： 解：（1）基因表達(dá)載體的組成包括標(biāo)記基因（如抗性基因）、復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子和目的基因等，其中啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，可以驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄．
（2）PCR過程是在較高環(huán)境中進(jìn)行的，需要熱穩(wěn)定DNA聚合酶（taq酶）；在PCR過程中通過加熱（90-95℃）達(dá)到的結(jié)果，和體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)所需解旋酶的作用相同．
（3）將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞，常用感受體細(xì)胞法，即先用Ca²⁺處理，將其轉(zhuǎn)化為一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞．將人胰島素基因?qū)�入大腸桿菌內(nèi)且成功表達(dá)后，提取的產(chǎn)物還需進(jìn)行體外加工和改良，因?yàn)榇竽c桿菌是原核生物，其細(xì)胞中缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體，無法加工形成胰島素．
（4）DNA連接酶的作用是恢復(fù)磷酸二酯鍵；經(jīng)限制酶BamHⅠ處理后的質(zhì)粒與用另一種限制酶BglⅡ處理后得到的目的基因可以形成重組質(zhì)粒，說明限制酶BamHⅠ和限制酶BglⅡ的酶切產(chǎn)物具有相同末端．
（5）圖二中的菌落能抗氨芐青霉素，將滅菌絨布按到圖二中培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到圖三含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，仍能生長(zhǎng)的也能抗四環(huán)素，空圈為只能抗氨芐青霉素而不能抗四環(huán)素的．因此，圖三結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌既能抗氨芐青霉素，又能抗四環(huán)素，說明導(dǎo)入的是pBR322質(zhì)粒，而不是重組質(zhì)粒（重組質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因被切斷，不能表達(dá)，因此含重組質(zhì)粒的大腸桿菌抗氨芐青霉素）．
故答案為：
（1）啟動(dòng)子     
（2）熱穩(wěn)定     解旋酶
（3）農(nóng)桿菌     感受態(tài)        內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體
（4）磷酸二酯       相同末端
（5）抗氨芐青霉素不抗四環(huán)素（或只抗氨芐青霉素）     pBR322

點(diǎn)評(píng)：本題考查了基因工程的相關(guān)知識(shí)，意在考查考生理解所學(xué)知識(shí)的要點(diǎn)，把握知識(shí)間的內(nèi)在聯(lián)系的能力，及能會(huì)鑒別、選擇試題給出的圖表生物學(xué)信息，并能運(yùn)用這些信息，結(jié)合所學(xué)知識(shí)解決相關(guān)的生物學(xué)問題．